李學(xué)才，常 瑜，白 靜，武軍艷，李博文，趙玉紅，孫柏林，王萬鵬，唐德耀，范小龍，朱文英，馬 驪，孫萬倉

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州730020；3.甘肅省康縣茶葉科技開發(fā)中心，甘肅 隴南 746500；4.甘肅省崆峒區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 平?jīng)?744000)

世界上有灌溉條件的耕地面積尚不足15%，其余皆為依靠自然的雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)[1-2]。隨著氣候變暖及陸地表面趨向干旱化，水資源短缺成為限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素之一[3-4]。中國北方大部分地區(qū)屬干旱、半干旱地區(qū)，面積約占我國陸地面積的50%，其生態(tài)環(huán)境脆弱、氣候異常多變、水資源匱乏,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)因干旱受到嚴(yán)重?fù)p失[5]。

脫落酸(Abscisic acid，ABA)是一種重要的倍半萜類植物內(nèi)源激素，不僅參與胚胎發(fā)育、種子休眠、葉片衰老等生長發(fā)育過程，同時又是植物體內(nèi)的一種抗脅迫激素，參與傳遞逆境信號，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生一系列抗逆反應(yīng)，提高植物的抗逆性。玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(Zeaxanthin epoxidase，ZEP)是一種類囊體膜基質(zhì)面的雙功能單加氧酶，其主要作用是將玉米黃質(zhì)環(huán)氧化形成花藥黃質(zhì)，再進(jìn)一步環(huán)氧化形成紫黃質(zhì)。分子氧和NADPH是ZEP的協(xié)同作用底物，F(xiàn)AD是其輔助因子，能夠提高其催化活性[6]。研究表明ZEP是黃質(zhì)醛轉(zhuǎn)變成ABA的間接合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶[7]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中ABA1缺失突變體表現(xiàn)為玉米黃質(zhì)無法轉(zhuǎn)化為紫黃質(zhì)，煙草中則為ABA合成反應(yīng)第一步無法進(jìn)行[8]。ZEP在不同環(huán)境脅迫下的表達(dá)模式隨植物種類和組織而發(fā)生變化。在煙草和番茄中，根中ZEP的表達(dá)量在干旱脅迫后顯著上升，而葉片中的表達(dá)量基本不發(fā)生變化[9-10]。Audran等[11]卻發(fā)現(xiàn)煙草葉片中ZEP的表達(dá)量在干旱脅迫下急劇下降。過表達(dá)ZEP會導(dǎo)致番茄對強(qiáng)光的敏感性增加，也會使轉(zhuǎn)基因擬南芥中ABA含量上調(diào)[12-13]。Park等[14]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥過表達(dá)AtZEP基因，轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫和旱脅迫條件下生長更旺盛。通過RNA-seq技術(shù)對甘藍(lán)型油菜的耐旱基因進(jìn)行挖掘發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下ZEP、NCED等參與ABA合成基因的高表達(dá)提高植株的耐旱性[15]。在逆境條件下，植物體內(nèi)合成大量的ABA，可以促進(jìn)氣孔關(guān)閉，抑制氣孔開放，抑制植物的光合作用，從而減緩逆境環(huán)境對植物造成的傷害，增強(qiáng)植物的抗逆性。

白菜型冬油菜是我國北方寒旱區(qū)重要油料作物之一，具有生育期短、耐遲播、耐貧瘠、抗逆性強(qiáng)的突出優(yōu)點。北方白菜型冬油菜3月中下旬開始返青，進(jìn)入需水旺盛期，但北方4—6月為旱季，7—9月才進(jìn)入降雨期，油菜返青后需水期與降雨期不同步，對北方冬油菜生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響[16]。因此，研究北方白菜型冬油菜的抗旱性具有重要意義。本課題組前期研究表明[17]，超強(qiáng)抗寒白菜型冬油菜品種根系及葉片的ABA含量升高時期早于弱寒性品種，白菜型冬油菜根系A(chǔ)BA 含量與其越冬率和抗寒性呈顯著正相關(guān)。因此，本研究對ABA合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶基因ZEP進(jìn)行克隆并分析其在干旱脅迫下的表達(dá)模式，進(jìn)一步揭示ZEP基因在白菜型冬油菜抗旱響應(yīng)中的作用，為白菜型冬油菜抗旱機(jī)理研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及脅迫處理

以白菜型冬油菜隴油7號和天油4號為試驗材料。選擇健康、均勻的種子用0.1% NaClO消毒10 min后，用蒸餾水沖洗2～3次，播種在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行種子萌發(fā)(光照14 h，25℃；黑暗10 h, 25℃)，待胚根露白后播種至裝有基質(zhì)的花盆中，培養(yǎng)至五葉期選擇生長健康的植株進(jìn)行脅迫處理。

試驗設(shè)置4個處理：T1：對照(CK)，噴施蒸餾水200 mL；T2：噴施20 mg·L-1ABA 200 mL；T3：噴施10 mmol·L-1鎢酸鈉200 mL；T4：同時噴施20 mg·L-1ABA 100 mL和10 mmol·L-1鎢酸鈉100 mL。試驗材料處理前7 d始終保持花盆內(nèi)土壤持水量在70%～80%，并用土壤水分儀(恒美HM-WSYP)監(jiān)測每日土壤含水量[18]。將試驗材料放置于光照培養(yǎng)箱中(光照14 h，25℃；黑暗10 h，25℃；相對濕度45%)進(jìn)行干旱處理，取第0天(Normal)和第7天(Drought)植株葉片和根系，并液氮冷凍后存儲于-80℃冰箱。

1.2 ZEP基因的克隆

參照TIANGEN天根生化科技(北京)有限公司試劑盒(DP419)說明書提取總RNA，質(zhì)量檢測后按照TakaRa大連寶生物有限公司PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒的方法合成cDNA，檢測質(zhì)量及濃度后-20℃保存。

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的白菜型油菜的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(ZEP)基因的CDS序列，利用Primer 5.0設(shè)計擴(kuò)增引物。引物序列為ZEP-F：5’-ATGGGTTGTTCAACTCCCTTCTGCT-3’；ZEP-R：5’- TCAAGCAGCCTGAAGCAATTTACCG -3’。以隴油7號(CK)葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min；16℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，參照Axygen Prep DNA凝膠回收試劑盒(離心柱型)說明書回收目的條帶。采用pMD-19T載體連接回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆進(jìn)行測序(生工生物工程上海股份有限公司)。

1.3 ZEP基因的生物信息學(xué)分析

采用ORF Finder軟件對ZEP的核酸序列、氨基酸序列和開放閱讀框進(jìn)行分析，利用Protparam工具進(jìn)行蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析，氨基酸疏水性分析采用Protscale，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測采用TMpred Server軟件，采用Signal P4.1 Server預(yù)測蛋白信號肽，利用SOPMA工具預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，保守結(jié)構(gòu)域分析用SMART工具。利用DNAMAN進(jìn)行白菜型冬油菜ZEP基因的氨基酸序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.4 ZEP基因的表達(dá)量

依據(jù)實時熒光定量PCR引物設(shè)計原則設(shè)計白菜型油菜ZEP基因(XM_009105212.3)qPCR引物。以相同濃度隴油7號和天油4號cDNA為模板，以白菜型油菜β-actin(Actin-F，5'-GTGTCATGGTTGGGATGGGT-3';Actin-R，5'-AAGAACCGGGTGCTCTTCAG-3')作為內(nèi)參[15]。實時熒光定量PCR按照Unique Aptamer TM qPCR SYBR? Green Master Mix試劑盒說明書(天津諾禾致源生物信息科技有限公司)，采用兩步法，擴(kuò)增程序為：95℃ 5 min；95℃ 10 sec，60℃ 30 sec，40個循環(huán)；熔解曲線：95℃ 15 sec，60℃ 60 sec，95℃ 15 sec。采用2-ΔΔCt法[19]對ZEP基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜型冬油菜ZEP基因克隆及序列分析

以隴油7號葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化回收目的片段，連接T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用菌液PCR篩選陽性克隆，得到一條2 000 bp左右的目的片段(圖1)。對挑選的陽性克隆進(jìn)行測序，結(jié)果顯示該基因全長為2 013 bp。

利用NCBI ORF finder對隴油7號的ZEP基因堿基序列查找開放閱讀框，結(jié)果顯示，該序列含有一個長度為2 013 bp的完整開放閱讀框，編碼含670個氨基酸的蛋白質(zhì)，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA(圖2)。利用ProtParam在線軟件預(yù)測ZEP基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示：ZEP蛋白的分子式為C3294H5172N912O980S25，由20種氨基酸組成，Gly(G)、Leu(L)所占比例最高，分別為10.0%、8.2%；含有酸性氨基酸(D、E)88個、堿性氨基酸(K、R)83個、疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)234個和極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)142個；預(yù)測相對分子質(zhì)量為74.03 kDa，理論等電點(pI)為6.16；預(yù)測不穩(wěn)定指數(shù)為46.09，屬于不穩(wěn)定蛋白(穩(wěn)定系數(shù)>40即為不穩(wěn)定蛋白質(zhì))；預(yù)測脂肪指數(shù)為81.94，平均親水性值(Grand average of hydropathicity)為-0.261(圖3A)，說明ZEP基因編碼的蛋白是親水性蛋白。

白菜型冬油菜隴油7號ZEP蛋白的N-末端信號肽預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白無信號肽(圖3B)。利用TMpred分析ZEP蛋白氨基酸序列，結(jié)果顯示含有3個跨膜區(qū)段(圖3C)；利用SOPMA 預(yù)測ZEP蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白無規(guī)則卷曲(Random coil)占42.39%，α-螺旋(α-helix)占30.45%，延伸鏈(Extended strand)占19.85%，β-轉(zhuǎn)角(β-turn)占7.31%(圖3D)。采用SMART在線軟件對隴油7號ZEP保守序列進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白具有非常保守的結(jié)構(gòu)域：黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合位點和57個氨基酸組成的FHA結(jié)構(gòu)域(圖3E)。

2.2 隴油7號ZEP蛋白同源性和親緣關(guān)系

利用DNAMAN及BLASTP對隴油7號與其他十字花科植物ZEP蛋白同源性進(jìn)行比較，結(jié)果表明，隴油7號ZEP蛋白序列與其他植物的ZEP氨基酸序列相似性很高，與甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、大白菜、蘿卜以及擬南芥ZEP基因的相似度分別為99.40%、97.16%、98.81%、95.52%、89.25%(圖4)。從進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，隴油7號與天油4號的ZEP蛋白在進(jìn)化上同甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)、大白菜(Brassicarapasubsp.pekinensis)的ZEP氨基酸序列親緣關(guān)系更近。

2.3 干旱處理后噴施ABA與鎢酸鈉對葉片ZEP基因表達(dá)的影響

利用qPCR分析外源噴施ABA與鎢酸鈉對干旱脅迫下白菜型冬油菜隴油7號、天油4號葉片中ZEP基因表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖6所示，將未進(jìn)行干旱處理的白菜型冬油菜葉片的ZEP基因的表達(dá)量定為Normal，干旱脅迫后隴油7號和天油4號葉片中ZEP基因均上調(diào)表達(dá)。干旱脅迫處理噴施ABA后，2個品種ZEP表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄水平上顯著高于CK，隴油7號、天油4號較CK分別增加66.63%、75.35%；干旱脅迫處理噴施鎢酸鈉后，2個品種的ZEP基因表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄水平上均低于CK，隴油7號、天油4號較CK分別減少12.74%、16.32%；干旱脅迫處理并同時噴施ABA和鎢酸鈉后，隴油7號、天油4號較CK的ZEP基因表達(dá)量分別增加3.3倍和2.28倍。

2.4 干旱處理后噴施ABA與鎢酸鈉對根系ZEP基因表達(dá)的影響

外源噴施ABA與鎢酸鈉對干旱脅迫下白菜型冬油菜根系中ZEP表達(dá)量的影響如圖7所示，未進(jìn)行干旱處理的白菜型冬油菜根系的ZEP基因的表達(dá)量為1，隴油7號和天油4號2個品種ZEP基因均上調(diào)表達(dá)。噴施ABA干旱處理后，隴油7號、天油4號較CK的基因表達(dá)量分別增加1.18倍和1.74倍。噴施鎢酸鈉根系中ZEP在轉(zhuǎn)錄水平上低于CK，干旱脅迫后，隴油7號、天油4號較CK減少了12.52%和11.44%。同時噴施ABA和鎢酸鈉，干旱脅迫下，隴油7號、天油4號較CK的基因表達(dá)量分別增加1.07倍和1.27倍。

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫下，植物對外界環(huán)境的刺激做出反應(yīng)，產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物以適應(yīng)外界環(huán)境。ABA是植物產(chǎn)生的重要激素，在逆境脅迫中可調(diào)節(jié)植物的代謝活動，提高植物的抗逆能力。ABA在植物受干旱脅迫時通過信號傳導(dǎo)，調(diào)控脅迫基因表達(dá)，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)蛋白、激素等物質(zhì)的積累，從而增強(qiáng)植物對環(huán)境的適應(yīng)能力[20]。玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶ZEP是ABA合成反應(yīng)第一步的調(diào)控酶，催化玉米黃質(zhì)(Z)經(jīng)單環(huán)氧玉米黃質(zhì)(A)向雙環(huán)氧紫黃質(zhì)(V)的轉(zhuǎn)化[21-22]。這一反應(yīng)在植物葉黃素循環(huán)途徑、ABA合成途徑以及類胡蘿卜素循環(huán)中都具有重要作用[23-25]。ABA 合成抑制劑鎢酸鈉通過抑制 ABA 合成中的醛氧化酶原(ABA-aldehydeoxidase)使得 ABA 醛不能轉(zhuǎn)化為 ABA[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，白菜型冬油菜葉片和根系中ZEP基因均上調(diào)表達(dá)。鄧昌哲等[27]研究表明，ABA合成抑制劑在類胡蘿卜素降解途徑中可抑制ZEP的表達(dá)，本試驗發(fā)現(xiàn)，噴施ABA后，無論葉片或根中，ZEP基因的相對表達(dá)量均顯著高于對照，說明ABA可以誘導(dǎo)ZEP基因的表達(dá)。本試驗研究表明，外源噴施鎢酸鈉后，白菜型冬油菜葉片和根中的ZEP基因表達(dá)受到抑制，相對表達(dá)量顯著低于對照。

ZEP是一種雙功能單加氧酶，也是ABA合成途徑中的調(diào)控酶之一，屬于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族[28]，主要定位到葉綠體類囊體膜和外被膜上[29-30]。本試驗成功克隆了白菜型冬油菜的ZEP基因，包含2 013 bp的開放閱讀框，編碼含670個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為74.03kDa，理論等電點(pI)為6.16，包含F(xiàn)AD-binding 3結(jié)構(gòu)域及FHA結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)果與甘藍(lán)型油菜和紫花苜蓿中的研究相似[31-32]。ZEP不僅是ABA間接合成過程中的作用酶，也是葉黃素循環(huán)中的關(guān)鍵酶。本試驗從白菜型冬油菜隴油7號和天油4號中成功克隆出ZEP基因序列，與擬南芥、甘藍(lán)型油菜等進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其同源性分別為89.70%和99.40%。經(jīng)qPCR分析發(fā)現(xiàn)，ZEP基因在白菜型冬油菜葉片和根系中均有表達(dá)，與煙草ABA2、番茄NpZEP的表達(dá)模式相似，葉片中的表達(dá)量最高，根系表達(dá)量較少[12,33]。且干旱脅迫下，葉片和根系中均有表達(dá)，說明ZEP基因在白菜型冬油菜抗旱中發(fā)揮作用。