哈再古麗·賈漢 阿依恒·曲庫爾汗 馮娟 阿不都許庫爾·吾買爾

(1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，新疆 烏魯木齊 830028)

老年性聽力損傷(Age-Related Hearing Loss, AHL)是一類由遺傳、免疫、炎癥等多種因素共同參與產(chǎn)生的老年感知性疾病[1-2]，病情呈緩慢性加重，嚴重影響老年患者的生活質(zhì)量。多種microRNAs(miRNAs)可在轉(zhuǎn)錄后水平通過調(diào)控基因沉默復合體(RNA-Induced Silencing Complex, RISC)來影響聽覺相關分子的表達[3]，從而參與AHL疾病的發(fā)生與進展[4-5]，其中大量數(shù)據(jù)證實miR-34a可以通過miR-34a/SIRT1/p53、miR-34a/Bcl-2等信號通路來介導耳蝸毛細胞凋亡[6-7]，并能夠作為潛在的AHL治療靶點而受到廣泛關注。另外，最新研究通過篩查AHL模型小鼠發(fā)現(xiàn)Sestrin 2(SESN2)表達顯著降低[8]，且進一步生物信息學分析提示SESN2的3′非翻譯區(qū)(3′ UTR)存在與miR-34a的靶向結(jié)合位點[9-10]。然而，關于miR-34a與SESN2在AHL發(fā)生、發(fā)展中的相互作用關系及機制報道鮮少，因此本研究旨在通過探討兩者在耳蝸毛細胞增殖及凋亡中的作用機制，為靶向miR-34a治療AHL提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 耳蝸毛細胞系HEI-OC1購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、高糖DMEM培養(yǎng)基、PBS及0.25%胰蛋白酶溶液等購自美國Hyclone公司；Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑購自德國QIAGEN公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)、CCK-8試劑盒(Abmole)、TRIzol、RT-PCR試劑及Power Up SYBR Green Kit等均購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase, GSH-Px)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)ELISA檢測試劑盒等購自南京建成生物工程研究所；WB檢測抗體均購自Abcam; 雙螢光素酶報告載體pGL3購自美國Promega公司，相應pGL3-PIK3CA-SESN2-WT及突變型報告載體pGL3-PIK3CA-SESN2-Mut、SESN2過表達載體及同型陰性對照載體(Negative Control, NC)、miR-34a mimic及miR-34a無序?qū)φ瘴?NC mimic)等均由上海吉瑪生物公司設計合成，PCR檢測引物見表1。

表1 引物序列

1.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組 HEI-OC1細胞分組培養(yǎng)于24孔板中，組別設置為轉(zhuǎn)染SESN2同型陰性對照組(NC組)、轉(zhuǎn)染SESN2過表達載體組(SESN2組)、共轉(zhuǎn)染SESN2過表達載體及miR-34a mimic組(SESN2+miR-34a mimic組)。待板中細胞密度至50%后參照Effectene Transfection Reagent說明書分別轉(zhuǎn)染不同載體質(zhì)粒，常規(guī)培養(yǎng)48 h后換液收集轉(zhuǎn)染后的細胞經(jīng)測序驗證后用于后續(xù)實驗檢測。

1.3 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?根據(jù)TargetScan(http: //www.targetscan.org)預測的miR-34a與SESN2(NM0314593)靶向結(jié)合位點，克隆含miR-34a潛在結(jié)合位點的SESN2 3′UTR區(qū)的野生型pGL3-PIK3CA-SESN2-WT載體，擴增序列引物上游：5′-AT TGCCAAACCTCTGACTGCCA-3′，下游：5′-AATC GGATTCGGACTTCGGC-3′，定點突變核心序列“ACCTCT”后擴增得到突變型pGL3-PIK3CA-SESN2-Mut載體。分別將上述載體與miR-34a mimic或NC mimic共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，并用pRL-TK空載體轉(zhuǎn)染空白細胞做陰性對照，48 h后根據(jù)Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒說明書測定各組細胞相對螢光素酶活性。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖活力 96孔板中接種各組細胞，每組6個平行對照，參照Cell Counting Kit說明書于穩(wěn)定培養(yǎng)24、48、72 h后加入10 mL CCK-8試劑，賦予4 h。檢測各組細胞在450 nm處的吸光度(OD值)，計算分析各組細胞的增殖活性。

1.5 細胞凋亡檢測 收集各組細胞，調(diào)整細胞密度至4×105/mL，參照Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒說明書加入500 μl Binding Buffer重懸細胞后，避光依次加入5 μl的Annexin V染色液和10 μl PI染液，同時配置空白細胞樣品、單染Annexin V和單染PI樣品用于調(diào)節(jié)光路補償，染色15 min后上流式細胞儀檢測并計算各組細胞凋亡率。

1.6 細胞內(nèi)氧化應激指標檢測 消化收集上述3組細胞，PBS漂洗1次，采用超聲破碎儀裂解細胞，3000 r/min低速離心15 min，收集細胞裂解上清，參照SOD、CAT、GSH-Px、MDA試劑盒說明書檢測miR-34a與SESN2各組細胞內(nèi)氧化損傷相關分子的表達影響。

1.7 Western blot檢測細胞內(nèi)蛋白表達水平 收集各組細胞加入含1%PMSF的RIPA裂解液于冰上裂解細胞，并提取細胞蛋白，定量檢測后取等量蛋白行10% SDS-PAGE凝膠電泳，100 V恒壓電泳120 min; 電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移于活化的PVDF膜上，常規(guī)抗體孵育后滴加發(fā)光液曝光顯影，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，采集發(fā)光圖像分析相關蛋白表達水平。

1.8 qRT-PCR檢測細胞內(nèi)基因表達水平 參照TRIzol說明書裂解提取細胞總RNAs，逆轉(zhuǎn)合成cDNAs，標定各組樣本cDNAs濃度后參照Power Up SYBR Green Kit說明書定量檢測目的基因表達量。GADPH、U6擴增引物分別作為mRNA和miRNA的參比基因，每組細胞樣本設置3個平行對照，以采集到熒光信號均值(Ct值)計算2-△△Ct表示目的基因的相對表達量。同時做陰性對照用以排除反應體系內(nèi)PCR污染及引物二聚體干擾。

2 結(jié)果

2.1 miR-34a靶向調(diào)控SESN2表達 雙熒光素酶實驗結(jié)果表明，miR-34a能夠靶向抑制SESN2表達(圖1A)；WB及qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-34a能夠顯著抑制HEI-OC1細胞中SESN2的表達(圖1B)，而過表達SESN2能夠顯著抑制細胞內(nèi)miR-34a的表達量(圖1C)。

圖1 miR-34a與SESN2靶向結(jié)合并相互作用

2.2 miR-34a靶向調(diào)控SESN2表達參與影響HEI-OC1細胞增殖 CCK-8增殖實驗結(jié)果顯示，過表達SESN2能夠顯著促進HEI-OC1細胞增殖活力，與NC組細胞相比，48 h后SESN2組細胞增值活力顯著升高(P<0.001)，SESN2+miR-34a mimic組細胞的增殖活力無明顯變化(P>0.05)；而與SESN2組細胞相比，SESN2+ miR-34a mimic組細胞的增殖活力在48 h后明顯降低(P<0.05)，見圖2。

2.3 miR-34a靶向調(diào)控SESN2參與影響HEI-OC1細胞凋亡 與NC組HEI-OC1細胞相比，SESN2組細胞的凋亡率及細胞中促凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3表達均明顯降低，但凋亡抑制蛋白Bcl-2及AMPK信號通路相關蛋白AMPK磷酸化水平及SIRT1表達水平明顯增加(均P<0.05)，而SESN2+ miR-34a mimic組細胞的凋亡率及上述相關蛋白表達均無明顯差異(P>0.05)；但與SESN2組相比，SESN2+miR-34a mimic組細胞的凋亡率及促凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3表達明顯升高，凋亡抑制蛋白Bcl-2及AMPK信號通路相關蛋白AMPK磷酸化水平及SIRT1表達水平均明顯降低(均P<0.05)，見圖3。

2.4 miR-34a靶向調(diào)控SESN2參與影響HEI-OC1細胞氧化損傷 與NC組相比，SESN2組細胞能顯著促進HEI-OC1細胞中SOD、CAT及GSH-Px表達，并減少MDA表達(均P<0.05)，SESN2+miR-34a mimic組細胞中SOD、CAT及GSH-P表達均無明顯變化(P>0.05)；而與SESN2細胞相比，SESN2+miR-34a mimic組細胞中SOD、CAT及GSH-P表達均明顯降低，但MDA表達量顯著增加(均P<0.05)，見表2。

圖3 miR-34a靶向SESN2促進HEI-OC1細胞凋亡

表2 miR-34a靶向SESN2參與調(diào)控HEI-OC1細胞氧化應激水平

3 討論

SESN2蛋白是應激誘導蛋白SESNs家族的重要成員，最初被發(fā)現(xiàn)確定為p53靶基因[11-12]，發(fā)揮維持代謝、增強自噬及調(diào)控細胞增殖等生物學作用，特別是在代謝及年齡相關性疾病中，胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝及動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生、發(fā)展都與SESN2對脅迫免疫響應和炎癥激活有著或多或少的關系[13-14]。同時隨著研究的不斷深入，SESN2活化參與介導的下游AMPK/TSC2/mTOR、PERK/ERS、Nrf2-ARE等多種信號通路的激活及分子調(diào)控機制被不斷揭示[15-17]，而SESN2的表達抑制及應激條件激活又受到何種分子或信號的調(diào)控尚未完全闡明。因此，本研究驗證了SESN2與miR-34a在HEI-OC1細胞中的相互作用關系，并初步揭示了兩者在耳蝸毛細胞凋亡中作用及機制。

通過構(gòu)建雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)染HEK293T模式細胞驗證miR-34a與SESN2 3′UTR區(qū)靶向結(jié)合可能，證明SESN2與miR-34a存在穩(wěn)定結(jié)合序列，且在定點突變該結(jié)合序列后miR-34a mimic不能結(jié)合并阻斷螢光素酶表達。進一步驗證兩者在HEI-OC1細胞中的的表達相關性，本研究采用HEI-OC1細胞相較于原代提取的體內(nèi)毛細胞具有一定的永生化能力，在包括AHL等多種聽覺相關疾病研究模型中得到廣泛應用，結(jié)果顯示SESN2與miR-34a在HEI-OC1細胞中的表達水平存在相互拮抗，miR-34a的過表達能夠顯著抑制SESN2 mRNA的轉(zhuǎn)錄及細胞內(nèi)SESN2蛋白的生成。以上結(jié)果顯示，miR-34a靶向結(jié)合并抑制SENS2的表達，其機制可能與miR-34a靶向結(jié)合SESN2并指導基因沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)[18]實現(xiàn)對SENS2 mRNA的降解及翻譯抑制有關。

隨后通過CCK-8、細胞凋亡及ELISA等方法檢測miR-34a靶向SESN2對HEI-OC1細胞體外增殖、凋亡及氧化損傷等方面的影響，結(jié)果顯示過表達SESN2能夠顯著促進HEI-OC1細胞增殖、抑制細胞凋亡并提高細胞抗氧化應激水平，反之過表達miR-34a則會削弱SESN2對HEI-OC1細胞的保護作用。根據(jù)相關文獻報道，miR-34a高表達于AHL患者中，并能夠通過抑制SIRT1表達參與介導耳蝸毛細胞凋亡[19]，同時研究發(fā)現(xiàn)在小鼠年齡相關性耳聾模型中，隨著年齡的增加SESN2的表達隨之減少[20]，且SESN2蛋白參與的自噬及凋亡調(diào)控被證實與SIRT1/AMPK信號轉(zhuǎn)導相關[21-22]，這提示在耳蝸毛細胞相關分子損傷中miR-34a的表達增加可能通過靶向抑制SESN2激活，減少應激蛋白表達，最終導致細胞損傷甚至凋亡。因此，本研究進一步檢測了細胞內(nèi)p-AMPK、AMPK、SIRT1蛋白表達變化及SESN2相關抗氧化損傷因子表達變化，結(jié)果顯示，與NC組相比，過表達SESN2能顯著促進SIRT1、p-AMPK/AMPK蛋白相對表達量增加，細胞內(nèi)抗氧化應激因子SOD、CAT及GSH-Px表達量隨SESN2增加而升高，提示SESN2可能通過調(diào)控AMPK/SIRT1信號通路降低HEI-OC1細胞氧化應激水平，提高細胞活性，抑制細胞凋亡，反之共轉(zhuǎn)染miR-34a mimic抑制SESN2的表達進而抑制了細胞內(nèi)SIRT1、p-AMPK/AMPK、SOD、CAT及GSH-Px蛋白的表達，促進MDA表達，最終造成細胞氧化損傷、誘導細胞凋亡的發(fā)生。這提示，miR-34a靶向SENS2參與介導AMPK/SIRT1信號通路表達調(diào)控并促進耳蝸毛細胞凋亡。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，miR-34a能通過靶向抑制SENS2表達，促進AMPK/SIRT1信號通路激活、抑制細胞內(nèi)抗氧化應激因子SOD、CAT及GSH-Px表達促進細胞氧化損傷，miR-34a靶向SENS2對HEI-OC1細胞凋亡具有促進作用。