陸月盈，付玉明?，劉 紅

(1. 北京航空航天大學生物與醫(yī)學工程學院， 北京100191；2. 北京航空航天大學生物醫(yī)學工程高精尖創(chuàng)新中心， 北京100191；3. 北京航空航天大學空天生物技術(shù)與醫(yī)學工程國際聯(lián)合研究中心， 北京100191)

1 引言

載人航天器為航天員工作生活提供適宜環(huán)境的同時，也為微生物的滋生提供了有利條件。1986 年開始服役的和平號空間站到其完成使命墜毀期間一直受到微生物的破壞。 在國際空間站中發(fā)現(xiàn)了234 種微生物存在，其中，真菌126種，細菌108 種。 這些大量滋生的微生物不僅會腐蝕降解材料、毀壞空間站設(shè)備，一些致病性微生物還會給航天員帶來健康問題。 因此，及時有效地對空間站等空間密閉艙室中的微生物進行監(jiān)測與控制，對空間站的建設(shè)及在太空中穩(wěn)健生存具有重大意義。

目前，空間站等在軌飛行器采用常規(guī)培養(yǎng)與快速檢測相結(jié)合、在軌培養(yǎng)與地面分析相結(jié)合的方式來監(jiān)測分析材料表面的微生物數(shù)量。 常規(guī)培養(yǎng)包括培養(yǎng)基接觸片和表面采樣拭子，此方法簡單實用，但所需分析時間長，在軌培養(yǎng)至少需要72 h，且成本較高；另外，采樣拭子擦拭取樣，不能直接用于不能接觸的部分或?qū)τ糜谌拥乃|(zhì)敏感的部分。 快速檢測方法包括使用手持微生物檢測設(shè)備—LOCAD-PTS 微生物檢測裝置和基于腺嘌呤核苷三磷酸 ( Adenosine triphosphate，ATP) 生物發(fā)光的微生物檢測方法，此方法可大大縮短時間，但成本較高，并且可能由于生物材料中存在的ATP 而干擾檢測結(jié)果。 為此，急需尋求一種快速有效、非侵入式、非破壞性的技術(shù)來監(jiān)測評估微生物污染情況。

圖像信息是人類獲得外界信息的主要來源?；趫D像處理與視覺分析的菌落圖像自動分析系統(tǒng)能夠自動、快速、客觀地統(tǒng)計圖像中包含的菌落數(shù)目并提取菌落的各種特征參數(shù)，極大地減輕了工作量，從而得到了廣泛的應(yīng)用。 國際上也正在研究新的影像技術(shù)來對航天器上的微生物進行監(jiān)測評估。 機器學習是用計算機來模擬或?qū)崿F(xiàn)人類的學習行為，隨著新興算法的不斷提出，其在圖像識別與圖像分類中的應(yīng)用也越來越廣泛。Jiao 等選取了30 種微生物，通過卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)提取圖像特征，然后通過傳統(tǒng)的隨機森林算法完成了最終的分類任務(wù)，但是準確率不高，且沒有用多種算法進行比較分析。

針對空間艙室內(nèi)滋生的特定微生物，尚未有利用機器學習算法進行圖像識別和分類的研究。因此，本文提出一種基于機器學習和數(shù)字圖像分析監(jiān)測評估密閉艙室表面微生物污染的方法，以期快速實時得到表面微生物覆蓋面積，從而表征微生物污染情況。

2 數(shù)據(jù)集

2.1 真菌腐蝕實驗

選取空間密閉艙室的4 種常見真菌——芽枝狀枝孢霉(cladosporium cladosporioides)、黑曲霉( aspergillus niger )、 雜 色 曲 霉 ( aspergillus versicolor)、金灰青霉(penicillium aurantiogriseum)作為實驗菌株，接種在航天領(lǐng)域中常見的鋁合金板(5A06)材料表面并進行培養(yǎng)。

2.1.1 實驗板材的處理

將鋁合金板裁剪為5 cm×5 cm 的薄片，并使用砂紙對其進行機械老化，便于細菌粘附定殖，同時防止后續(xù)照相時出現(xiàn)嚴重的反光現(xiàn)象。

2.1.2 培養(yǎng)基的配置

實驗選用孟加拉紅、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)和馬鈴薯葡萄糖肉湯(Potato Dextrose Broth，PDB)培養(yǎng)基3 種，分別用于真菌計數(shù)、擴大培養(yǎng)及菌株活化。

2.1.3 真菌接種

在一次性培養(yǎng)皿的底部和蓋子上分別放置經(jīng)無菌超純水充分濕潤的定性濾紙，營造濕潤的適宜真菌生長的環(huán)境。 將鋁合金板材料放置在一次性平板中，并在材料表面噴灑適量的未凝固的滅菌過的PDA 培養(yǎng)基，用來模擬空間站等空間密閉艙室環(huán)境中的富營養(yǎng)環(huán)境。 待冷卻1 h 后，將制備好的真菌孢子懸浮液用噴壺噴灑到鋁合金板材料表面，放入培養(yǎng)箱進行連續(xù)培養(yǎng)，溫度為28 ℃，相對濕度為65%。

2.2 真菌滋生圖像及生物量數(shù)據(jù)獲取

培養(yǎng)3 天后，將接種后的鋁合金板材料從培養(yǎng)箱中取出，拆除封口膜，使用佳能(Canon) EOS 70D 相機在相同的環(huán)境和參數(shù)下對鋁合金板材料進行拍照獲得圖像數(shù)據(jù)，注意盡可能避免燈光反射。

隨機選擇部分鋁合金板材料，采用平板菌落計數(shù)法對其真菌生物量進行測定。

用滅菌后的刀片將材料表面真菌輕輕刮下，放入50 mL 離心管中，加入10 mL 磷酸鹽緩沖液、5 個直徑為6 mm 的玻璃球和20 個直徑為2 mm的玻璃球。 置于振蕩器中振蕩約15 ～20 min，使得真菌完全脫落，獲得含有全部真菌的磷酸鹽緩沖液。 根據(jù)真菌生長情況，對每個樣品進行3 個梯度稀釋(稀釋倍數(shù)為10、10、10)，然后分別吸取50 μL 加入到孟加拉紅培養(yǎng)基平板中，用涂布棒涂抹均勻，每個梯度設(shè)置3 個平行。 密封后倒置培養(yǎng)，溫度為28 ℃，相對濕度為65%。

培養(yǎng)2 天后，將平板放在菌落計數(shù)儀中進行計數(shù)。 然后算出同一個稀釋梯度下的3 個平板上的菌落平均數(shù)(N)和各板上真菌數(shù)量密度(ρ，CFU/cm)，計算公式如式(1)。

式中，N 為平板平均數(shù)，μ 為稀釋倍數(shù)，S 為材料面積。

對剩下的鋁合金板材料用真菌孢子懸浮液再次進行噴灑并培養(yǎng)，模擬空間站等空間密閉艙室環(huán)境中微生物多次污染情況。 之后每隔3 天將接種真菌的鋁合金板從培養(yǎng)箱中拿出進行上述操作，獲得不同時期的真菌圖像與生物量數(shù)據(jù)。

2.3 真菌生物量等級分類

經(jīng)過實驗與圖像采集工作，最后得到了4 種真菌分別在鋁合金板材料上生長的圖像，數(shù)量達到480 張。 首先按照真菌種類對這480 張圖像進行標注，劃分為4 類，然后根據(jù)上述得到的每個鋁合金板材料上真菌生長的微生物量，對每類真菌再進行更加細致的生物量的劃分。 根據(jù)4 種真菌在鋁合金板腐蝕能力、生長速率，依據(jù)生物量范圍，將鋁合金板上每種真菌分為大量、少量、微量3 個等級，如表1 所示。

表1 4 種典型真菌滋生生物量等級分類Table 1 Grades of four typical fungal-breeding biomass

2.4 真菌圖像數(shù)據(jù)的增強

采用 Retinex 算 法(Single Scale Retinex，SSR)對圖像進行光照補償處理，目的是補償圖像中的局部亮度，使局部明暗區(qū)域之間的間隙變平，真菌圖像更加清晰，微生物生長狀態(tài)更加明顯。

為增加原始圖像的數(shù)量和多樣性、提高模型的泛化能力、提升模型的魯棒性，采取鏡像翻轉(zhuǎn)、隨機裁剪、縮放3 種方法對圖像數(shù)據(jù)集進行擴增。 采用最近鄰插值法實現(xiàn)圖像縮放，其原理是提取原圖像中與其鄰域最近像素值作為目標圖像相對應(yīng)的像素值。 浮點坐標的像素值等于距離該點最近的輸入圖像的像素值。 通過以上方法，最終將真菌圖像數(shù)據(jù)集原有的480 張圖像擴增到了2229 張。

3 模型結(jié)構(gòu)

3.1 模型的框架結(jié)構(gòu)

采用的模型流程如圖1 所示。 首先輸入的是圖像數(shù)據(jù)，經(jīng)過特征提取算法得到25 個特征值組成25 維特征向量，采用主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)算法進行降維得到9 維特征向量。 然后進入分類器得到分類結(jié)果，本文訓練了2 種分類器：支持向量機(Support Vector Machine， SVM)和隨機森林，分別對真菌種類及真菌生物量等級進行識別，最終得到結(jié)果，并對其性能進行對比。

圖1 模型整體框架Fig.1 Overall framework of the model

3.2 圖像數(shù)據(jù)預處理

3.2.1 真菌滋生圖像的特征提取

對鋁合金板材料表面4 種典型真菌進行了顏色特征和紋理特征的提取，分別采用顏色矩、基于統(tǒng)計分析的灰度共生矩陣特征和局部二值模式(Local binary patterns，LBP)方法對其進行表征。

顏色矩的數(shù)學基礎(chǔ)在于圖像中任何的顏色分布均可用它的矩來表示，并且顏色分布信息主要集中在低階矩中。 提取了鋁合金板材料表面4 種典型真菌滋生圖像的R、G、B 3 個通道的一階顏色矩、二階顏色矩、三階顏色矩共9 個顏色特征。一階顏色矩、二階顏色矩、三階顏色矩分別對應(yīng)圖像的顏色均值、顏色標準方差和顏色分量的偏斜度即顏色非對稱性。

灰度共生矩陣是一種常用的統(tǒng)計方法，可以反映圖像灰度關(guān)于方向、相鄰間隔、變化幅度等特征的綜合信息。 本文計算了對比度、熵、角二階矩、能量、自相關(guān)性和逆差矩6 種統(tǒng)計量特征參數(shù)。

局部二值模式特征是一種視覺描述符，用于計算機視覺的分類。 計算公式如式(2)所示。

式中，p 表示3×3 窗口中除中心像素點外的第p 個像素點，I(c)表示中心像素點的灰度值，I(p)表示領(lǐng)域內(nèi)第p 個像素點的灰度值，s(x)公式如式(3)所示。

3.2.2 真菌滋生圖像特征降維

對鋁合金板表面4 種典型真菌滋生圖像提取顏色特征和紋理特征后，最終得到了25 維特征。這些特征之間可能存在相關(guān)性，會增加后續(xù)建模的復雜性，而且高維度的特征需要的樣本數(shù)量呈指數(shù)級增加。 所以采用PCA 算法對提取到的特征進行降維，用較少的綜合指標代表原始特征中的信息，加快計算速度。

原始的樣本數(shù)據(jù)經(jīng)過PCA 降維后會有一定的信息丟失，通過方差和表示樣本數(shù)據(jù)的特征信息。 當降維后的特征數(shù)為9 維時，方差和占比接近100%，基本保留了原始數(shù)據(jù)的信息，最終將得到的25 維特征向量通過PCA 降維到了9 維。

之后的模型構(gòu)建與驗證采用降維后的樣本數(shù)據(jù)集進行隨機拆分，劃分為訓練集和測試集，80%作為訓練樣本，分別采用SVM 模型和隨機森林模型對4 種典型真菌滋生圖像種類識別和生物量等級分類進行建模， 20%作為測試樣本，用于對模型的評價檢驗。

3.3 模型構(gòu)建方法

3.3.1 基于SVM 的真菌種類識別模型構(gòu)建

使用拆分的訓練集基于SVM 模型對鋁合金板表面4 種典型真菌種類識別模型進行訓練。 采用GridSearchCV 方法對表2 中SVM 不同核函數(shù)及參數(shù)進行網(wǎng)格搜索，進行5 折交叉驗證，以準確率為評價指標得到最優(yōu)的核函數(shù)及其參數(shù)。

網(wǎng)格搜索結(jié)果最優(yōu)參數(shù)組合為：核函數(shù)為多項式函數(shù)，懲罰因子C ＝10，多項式函數(shù)最高項次數(shù)Degree＝2，評價指標準確率為96.34%。

表2 SVM 核函數(shù)及參數(shù)Table 2 Kernel functions and parameters of SVM

在得到SVM 的最優(yōu)參數(shù)組合后，采用學習曲線來判斷訓練模型是否為欠擬合(underfitting)或過擬合(overfitting)。 將訓練集劃分為10 等分，在訓練模型時逐漸增加訓練集樣本，并計算在當前訓練樣本數(shù)量情況下訓練出來的模型準確性。

3.3.2 基于隨機森林的真菌種類識別模型構(gòu)建

與構(gòu)建SVM 分類器類似，也需要尋找構(gòu)建隨機森林模型的最優(yōu)參數(shù)。 利用GridSearchCV 對隨機森林的基評估器n_estimators的數(shù)量的最優(yōu)值進行搜索，基評估器數(shù)量越大，模型的效果越好。當數(shù)量達到一定程度之后，模型的效果將沒有明顯變化。 最終得到隨機森林模型最優(yōu)的基評估器的數(shù)量為40。 確定隨機森林模型的最優(yōu)參數(shù)后，采用學習曲線判斷隨機森林模型狀態(tài)。

3.3.3 真菌生物量分級識別模型構(gòu)建

分別對4 種真菌數(shù)據(jù)的訓練集采用網(wǎng)格搜索尋找SVM 分類器最優(yōu)參數(shù)組合。 從表3 中可以看出，4 種真菌生物量SVM 分級模型的最優(yōu)核函數(shù)都為多項式函數(shù)。 在尋找到最優(yōu)參數(shù)后，分別采用訓練集數(shù)據(jù)對鋁合金板表面4 種典型真菌滋生生物量分級模型進行構(gòu)建。

表3 SVM 模型最優(yōu)參數(shù)組合Table 3 Optimal parameter combination of SVM model

4 結(jié)果與討論

4.1 真菌滋生圖像

4 種真菌在鋁合金板材料表面的滋生情況如圖2 所示。 通過采用鏡像翻轉(zhuǎn)、隨機裁剪、縮放等方法對圖像集進行擴增，最終將已有的480 張圖像擴增到了2229 張。 其中，鋁合金板材料表面黑曲霉不同滋生狀況圖像一共495 張，依據(jù)材料表面生物量等級分為大量、少量、微量3 種等級的圖像各165 張；芽枝狀枝孢霉不同滋生狀況圖像一共534 張，生物量等級為大量、少量、微量3 種等級的圖像各178 張；金灰青霉不同滋生狀況圖像一共600 張，生物量等級為大量、少量、微量3種等級的圖像各200 張；雜色曲霉不同滋生狀況圖像一共600 張，生物量等級為大量、少量、微量3 種等級的圖像各200 張。

圖2 4 種真菌在鋁合金板材料表面滋生圖像Fig.2 Images of 4 kinds of fungi growing on the surface of aluminum alloy plate material

4.2 模型構(gòu)建結(jié)果

圖3 為在逐漸增加訓練樣本數(shù)據(jù)時SVM 模型在訓練集和驗證集上的準確率曲線。 從圖中可以看出，訓練集準確率與驗證集準確率隨著訓練樣本數(shù)據(jù)的增加在逐漸收斂，訓練集準確率高于驗證集準確率，并隨著訓練樣本的增加差距在減小，即過擬合狀態(tài)也在減小。

圖3 SVM 模型學習曲線Fig.3 Learning curve of SVM model

在確定SVM 模型最優(yōu)參數(shù)組合并且確定SVM 模型在訓練集準確率與驗證集準確率是收斂的后，采用拆分的訓練集來對鋁合金板表面4種典型真菌種類構(gòu)建識別模型。 采用SVM 進行分類的過程即為尋找類別之間的超平面，將不同類別分割。 對4 種典型真菌進行分類，則需要6個超平面將4 種典型真菌進行分割開來。 圖4 為在訓練模型時找到的6 個超平面及4 個類別數(shù)據(jù)到超平面的距離的直方圖。 其中，X ＝0 錯分，這是因為在訓練模型過程中允許分類器對一些樣本犯錯，避免SVM 分類器過擬合，降低了模型對噪聲點的敏感性，提升了模型的泛化性能。

圖4 訓練集到分割超平面距離直方圖Fig.4 Histogram of distance from training set to segmented hyperplane

圖5 為在逐漸增加訓練樣本數(shù)據(jù)時隨機森林模型在訓練集和驗證集上的準確率曲線。 從圖中可以看出，訓練集的準確率比測試集要高很多，表明隨機森林模型存在過擬合狀態(tài)。 但隨著樣本數(shù)量的增加，二者之間差距縮小，情況有所好轉(zhuǎn)，說明模型所需的訓練樣本數(shù)要足夠多才能學習到泛化能力。

圖5 隨機森林模型學習曲線Fig.5 Learning curve of random forest model

4.3 真菌種類分類任務(wù)

在使用訓練集對鋁合金板表面4 種典型真菌種類模型構(gòu)建好后，采用拆分的測試集分別驗證SVM 模型和隨機森林模型。 采用準確率來評價模型在測試集上的性能，為保證結(jié)果可靠，也在測試集上重復進行了20 次實驗，結(jié)果見表4。 SVM模型在訓練集和測試集上的平均準確率為99%和97%，隨機森林分類模型為95%和93%，均低4個百分點，識別效果明顯低于SVM 分類器。 因此， SVM 分類器更適用于鋁合金板材料表面真菌種類的識別。

表4 2 種模型對真菌種類識別準確率Table 4 Recognition accuracy rate of fungus species by two models

采用混淆矩陣、精確率、召回率指標精細評估了SVM 分類模型對鋁合金板材料表面真菌種類的識別結(jié)果，如圖6 所示。 由圖可見，SVM分類模型具有很好的性能，對每種真菌種類識別精確率和召回率都在90%以上。 其中，雜色曲霉菌種的識別效果最好，精確率和召回率均接近100%。

圖6 SVM 模型對真菌種類識別的混淆矩陣、精確率和召回率結(jié)果Fig.6 Confusion matrix， accuracy rate and recall rate of fungal species identification by SVM model

4.4 真菌生物量等級分類任務(wù)

在對鋁合金板表面4 種典型真菌種類識別模型構(gòu)建時，SVM 分類模型性能優(yōu)于隨機森林模型，所以生物量分級模型構(gòu)建時采用表現(xiàn)更好的SVM 分類器。

圖7 為SVM 模型進行20 次重復測試后平均準確率結(jié)果。 能夠看出，對4 種真菌生物量等級識別的準確率均達到97%以上，其中，對黑曲霉的識別效果最高，為99.53%。 同樣采用混淆矩陣、精確率和召回率來對其進行精細評估，其對每種真菌生物量等級識別精確率和召回率都在95%以上。

通過學習曲線可以看出，SVM 算法比隨機森林模型具有更優(yōu)秀的泛化能力，從而準確率要高于隨機森林模型，能夠在未來的航天器微生物污染的拍攝照片中加以應(yīng)用。

圖7 SVM 模型對4 種典型真菌生物量等級分類識別的測試集準確率Fig.7 Test set accuracy of four typical fungal biomass classification based on SVM model

5 結(jié)論

1)在真菌種類分類任務(wù)上，SVM 模型的準確率高于隨機森林模型；

2)在真菌種類和生物量等級分類任務(wù)上，SVM 模型的準確率均達到97%以上；

3)SVM 模型的真菌生物量等級分類效果優(yōu)于真菌種類分類效果。