虞鳳慧，成道泉，王祥傳，周 倩，吳文雷，張 騫，楊傳倫，韓立霞，吳 磊，劉海玉，徐澤平,4

（1黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東濱州256500；2京博農(nóng)化科技有限公司，山東濱州256500；3山東京博控股集團(tuán)有限公司，山東濱州256500；4濱州市環(huán)境微生物技術(shù)工程研究中心，山東濱州256500）

0 引言

番茄是中國(guó)設(shè)施（溫室）栽培面積最大的蔬菜，溫室番茄種植過程中常見的病害包括病毒病[1-2]以及灰葉斑病、葉霉病[3]、早疫病[4-6]、晚疫病[7-8]等真菌性病害。由于溫室小氣候具有高濕、低通風(fēng)、溫度高等特性，適合病原微生物生長(zhǎng)、繁殖和擴(kuò)散，使得病害易發(fā)、疊發(fā)、病情嚴(yán)重。高頻次、高劑量施藥是生產(chǎn)實(shí)踐中通常采用的病害防治方法，但也帶來農(nóng)藥抗性增強(qiáng)、農(nóng)藥殘留、勞動(dòng)量大等問題，同時(shí)對(duì)番茄品質(zhì)和產(chǎn)量造成很大影響。殼寡糖鋅是殼寡糖（又名氨基寡糖素[9]）與無機(jī)鋅經(jīng)過特定反應(yīng)形成的螯合物或配合物，是一種新型功能性肥料。殼寡糖鋅既保留了殼寡糖的原有活性，又為作物提供了生長(zhǎng)必需的鋅元素，并呈現(xiàn)出協(xié)同增效作用。因此，施用殼寡糖鋅可顯著增強(qiáng)作物抗病能力，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量，且有助于化肥、農(nóng)藥減量增效，提高農(nóng)產(chǎn)品安全性和農(nóng)戶經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。近年來，已有一些關(guān)于殼寡糖鋅及其相關(guān)產(chǎn)品在抑菌、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面的應(yīng)用報(bào)道[10-14]，如侯華民[15]等研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖鋅可使油菜產(chǎn)量提高16.5%。Higazy等[16]以殼聚糖(160000 Da)為原料，制備了殼聚糖鋅配合物，發(fā)現(xiàn)其對(duì)白色念珠菌和金黃色葡萄球菌具有顯著抑制活性[17]。盧琪潔等[17]以殼寡糖(500～1000 Da)為原料，制備了殼寡糖鋅配合物，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌效果較好。劉文歡等[18]將殼寡糖與硫酸鋅等營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)配，于小麥上噴施，可分別提高小麥產(chǎn)量和千粒重15.05%和12.39%以上。但總體來看，尚未有人對(duì)殼寡糖鋅防治作物病原菌的效果進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，也缺乏殼寡糖鋅在經(jīng)濟(jì)作物上的應(yīng)用表現(xiàn)數(shù)據(jù)，在一定程度上限制了該類產(chǎn)品的開發(fā)和推廣。而且，從已上市的產(chǎn)品來看，國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)殼寡糖鋅的廠家較少，國(guó)內(nèi)主要有北京標(biāo)馳農(nóng)業(yè)科技開發(fā)中心（產(chǎn)品為寡糖鋅）和海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司（產(chǎn)品為海洋寡糖鋅），國(guó)外主要為以色列海法農(nóng)業(yè)化學(xué)集團(tuán)。其他相關(guān)產(chǎn)品多為含鋅的殼寡糖復(fù)配產(chǎn)品。本研究產(chǎn)品為殼寡糖鋅螯合物，鋅與殼寡糖糖鏈中的-NH2結(jié)合，形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的螯合物，有別于殼寡糖與鋅鹽復(fù)配產(chǎn)品，螯合態(tài)的鋅更容易被作物吸收利用[19-22]。殼寡糖鋅屬于安全、綠色、環(huán)保型農(nóng)用產(chǎn)品，目前，關(guān)于殼寡糖鋅在作物抗病、促生、增產(chǎn)方面的報(bào)道較少。本研究以溫室番茄為供試作物，自番茄幼苗期開始施用殼寡糖鋅，研究其對(duì)番茄的防病效果及果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量的影響。期望為綠色農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試番茄：‘粉德利618’，購(gòu)于壽光市金農(nóng)種業(yè)。

供試藥劑：殼寡糖鋅（有效物質(zhì)含量3.45%），本實(shí)驗(yàn)室自制；氫氧化銅制劑、苦參總堿、稻瘟酰胺（有效物質(zhì)含量20%），市售產(chǎn)品。

供試病原菌：黃瓜角斑病原菌(Pseudomonas syringaepv.lachrymans)、姜瘟病原菌(Ralstonia solanacearum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、辣椒疫霉病原菌(Phytophthora capsiciLeonian)、蘋果腐爛病原菌(Valsa mali Miyabeet Yamada)、小麥赤霉病原菌(FusaHum graminearumSehw)、水稻紋枯病原菌(Rhizoctonia solaniKühn)和棉花枯萎病原菌(Fusarium oxysporumf.sp.Vesinfectum)，本實(shí)驗(yàn)室保存。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20 g，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，煮沸30 min，紗布過濾，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，121℃滅菌20 min。

1.2 主要儀器

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-Q全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼寡糖鋅對(duì)細(xì)菌的抑制作用 選取黃瓜角斑病原菌、姜瘟病原菌、大腸桿菌3種細(xì)菌為抑菌對(duì)象，活化菌種，確定最適菌液濃度。配制LB固體培養(yǎng)基、滅菌，培養(yǎng)基冷卻至40～50℃時(shí)，加入不同濃度的藥劑，制成含藥平板。以不加任何藥劑的LB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。取1×106CFU/mL的菌液100 μL均勻涂布于平板上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，根據(jù)菌落個(gè)數(shù)確定最低抑菌濃度(MIC)。

1.3.2 殼寡糖鋅對(duì)真菌的抑制作用 選取辣椒疫霉病原菌、蘋果腐爛病原菌、小麥赤霉病原菌、水稻紋枯病原菌和棉花枯萎病原菌為抑菌對(duì)象，活化菌種。配制PDA固體培養(yǎng)基，滅菌，培養(yǎng)基冷卻至40～50℃時(shí)，加入不同濃度的藥劑，制成含藥平板。以不加任何藥劑的PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。用直徑6 mm的打孔器取已活化的病原菌菌塊，菌絲面朝下，接種于含藥平板中央，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)5天。用十字交叉法量取菌落直徑并計(jì)算抑制率，確定最低抑菌濃度(MIC)。

1.3.3 殼寡糖鋅對(duì)番茄病害的防治效果 試驗(yàn)在山東博華高效生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司蔬菜基地的番茄溫室中進(jìn)行。供試土壤肥力中等，長(zhǎng)期以種植蔬菜為主。試驗(yàn)組噴施殼寡糖鋅，對(duì)照組未噴施殼寡糖鋅（溫室正常管理），面積各0.067 hm2。采用莖葉噴霧法，分別在番茄幼苗期（定植1周后）、開花尾期、結(jié)果期施藥，每個(gè)時(shí)期各施藥2次，每次間隔7～10天，殼寡糖鋅用量為2.25 L/(hm2·次)。每次施藥前后，觀察番茄植株發(fā)病情況。

1.3.4 殼寡糖鋅對(duì)番茄植株生長(zhǎng)、果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量的影響 在溫室番茄生長(zhǎng)的整個(gè)時(shí)期，觀察番茄的生長(zhǎng)情況，測(cè)量番茄株高和莖粗，確定相對(duì)增長(zhǎng)量。同時(shí)，隨機(jī)取樣，測(cè)定成熟番茄中可溶性固形物、總酸、還原糖、維生素C、鋅的含量，計(jì)算固酸比，評(píng)價(jià)番茄品質(zhì)，測(cè)定產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖鋅對(duì)細(xì)菌的抑制作用

由表1可知，在對(duì)細(xì)菌性病原菌的抑菌實(shí)驗(yàn)中，殼寡糖鋅與對(duì)照藥劑—?dú)す烟恰溲趸~制劑和苦參總堿對(duì)黃瓜角斑病原菌、姜瘟病原菌和大腸桿菌均有不同程度的抑制作用，且隨著藥劑濃度的增加，抑菌效果增強(qiáng)。根據(jù)平板上菌落數(shù)量確定各藥劑的最低抑菌濃度(MIC)，如表2所示。

表1 不同藥劑對(duì)細(xì)菌的抑制效果 菌落數(shù)/個(gè)

由表2可知，與作物細(xì)菌性病害常用的防治農(nóng)藥—?dú)溲趸~制劑和植物性殺菌劑—苦參總堿相比，殼寡糖鋅對(duì)黃瓜角斑病原菌、姜瘟病原菌和大腸桿菌的抑制效果最好，MIC值均為0.05%，較對(duì)照藥劑降低50%～75%。同時(shí)，殼寡糖鋅對(duì)3種病原菌的MIC值僅為殼寡糖的1/2～1/4，這可能與兩者不同的抑菌機(jī)制有關(guān)。殼寡糖在中性環(huán)境中帶正電荷，正電荷與微生物細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷之間的相互作用，改變了微生物細(xì)胞膜的通透性，引起微生物細(xì)胞死亡[23]，這種作用具有高度的劑量依賴性。殼寡糖鋅呈電中性，容易穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，并在胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)闅す烟呛弯\，殼寡糖能夠與胞內(nèi)核酸、蛋白等大分子結(jié)合，干擾細(xì)胞正常代謝，引起細(xì)胞死亡。

表2 不同藥劑對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)

2.2 殼寡糖鋅對(duì)真菌的抑制作用

由表3可知，在對(duì)真菌性病原菌的抑菌實(shí)驗(yàn)中，殼寡糖鋅對(duì)辣椒疫霉病原菌、蘋果腐爛病原菌、小麥赤霉病原菌、水稻紋枯病原菌和棉花枯萎病原菌均有一定抑制作用，且隨著藥劑濃度的增加，抑菌效果增強(qiáng)。而稻瘟酰胺的抑菌效果次之，隨著藥劑濃度的增加，稻瘟酰胺對(duì)小麥赤霉病原菌、水稻紋枯病原菌和棉花枯萎病原菌的抑菌效果無明顯增強(qiáng)，且藥劑效果不穩(wěn)定。根據(jù)菌絲抑制率確定各藥劑的MIC，如表4所示。

表3 不同藥劑對(duì)真菌的抑制效果

表4 不同藥劑對(duì)真菌的最低抑菌濃度(MIC)

由表4可知，與作物真菌性病害常用的防治農(nóng)藥—稻瘟酰胺相比，雖然殼寡糖鋅對(duì)真菌性病原菌的MIC無明顯降低，但其抑菌譜相對(duì)較廣，對(duì)5種病原菌均有抑制作用。而稻瘟酰胺僅對(duì)辣椒疫霉病原菌和蘋果腐爛病原菌有較好抑制作用。由此可見，殼寡糖鋅綜合抑菌效果優(yōu)于對(duì)照藥劑—稻瘟酰胺。

鑒于殼寡糖鋅對(duì)細(xì)菌性和真菌性病原菌均有較好的抑制作用，因此，通過田間試驗(yàn)驗(yàn)證殼寡糖鋅對(duì)溫室番茄病害的防治效果，以及對(duì)番茄植株生長(zhǎng)、果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量的影響。

2.3 殼寡糖鋅對(duì)番茄病害的防治效果

在番茄生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期施藥前后，觀察植株發(fā)生病害情況。如圖1所示，番茄成熟期，試驗(yàn)溫室的番茄植株發(fā)生了較為嚴(yán)重的病害，相比于對(duì)照組，噴施殼寡糖鋅的番茄植株發(fā)病數(shù)量明顯減少，且病情較輕，整片葉子幾乎無明顯的斑點(diǎn)。比較而言，殼寡糖鋅對(duì)溫室番茄病害呈現(xiàn)出明顯的防治效果。

圖1 殼寡糖鋅對(duì)番茄病害的防治效果

2.4 殼寡糖鋅對(duì)番茄植株生長(zhǎng)、果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量的影響

2.4.1 殼寡糖鋅對(duì)番茄植株生長(zhǎng)的影響 在番茄幼苗期，于噴施藥劑前后（施藥2次），分別隨機(jī)選取20株番茄植株，利用卷尺和游標(biāo)卡尺分別測(cè)量株高和莖粗，并計(jì)算平均相對(duì)增量，結(jié)果見表5。后期番茄植株太高，測(cè)量誤差較大，不再統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)量。

由表5可知，與對(duì)照組相比，噴施殼寡糖鋅的實(shí)驗(yàn)組番茄株高增長(zhǎng)17.11%，莖粗增長(zhǎng)53.89%。

表5 殼寡糖鋅對(duì)番茄植株生長(zhǎng)的影響

2.4.2 殼寡糖鋅對(duì)番茄品質(zhì)的影響 在番茄成熟期，隨機(jī)選取成熟度一致的番茄，測(cè)定可溶性固形物、總酸、還原糖、維生素C、鋅的含量，方法分別為NY/T 2637-2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測(cè)定折射儀法》、GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定酸堿滴定法》、DNS法、GB 6195-86《水果、蔬菜維生素C含量測(cè)定（2,6-二氯靛酚滴定法）》、ICP-MS，并計(jì)算固酸比。

與對(duì)照組相比（見表6），在番茄生長(zhǎng)整期，噴施殼寡糖鋅使番茄酸度降低了5.38%，同時(shí)，顯著提高了番茄的可溶性固形物、還原糖、維生素C、鋅含量及固酸比，相對(duì)增量依次為5.88%、27.88%、51.60%、87.91%、11.90%。其中，鋅含量大幅增加。

表6 殼寡糖鋅對(duì)番茄品質(zhì)的影響

2.4.3 殼寡糖鋅對(duì)番茄產(chǎn)量的影響 在番茄收獲階段，分別統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)組和對(duì)照組番茄總產(chǎn)量以及一級(jí)果、二級(jí)果、次果的總量，見圖2。

如圖2所示，噴施殼寡糖鋅后，番茄總產(chǎn)量和一級(jí)果產(chǎn)量顯著高于對(duì)照組，分別增產(chǎn)23.35%和30.73%，且未見二級(jí)果和次果。由此可見，自番茄幼苗期至結(jié)果期噴施殼寡糖鋅，可明顯提高番茄果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量。

圖2 殼寡糖鋅對(duì)番茄產(chǎn)量的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室將殼寡糖與鋅有機(jī)結(jié)合，開發(fā)出殼寡糖鋅螯合產(chǎn)品。本文研究了殼寡糖鋅對(duì)多種植物病原菌的抑制效果及其在溫室番茄上的應(yīng)用效果。從室內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)來看，殼寡糖鋅對(duì)多種植物細(xì)菌性和真菌性病原菌均具有較好的抑制效果，其MIC值與常用化學(xué)殺菌劑相比明顯降低。從對(duì)溫室番茄病害的防治效果來看，自番茄幼苗期開始，多次噴施殼寡糖鋅可明顯減少和減輕番茄植株病害的發(fā)生，與對(duì)照組差異顯著。從對(duì)番茄植株生長(zhǎng)的影響來看，殼寡糖鋅可同時(shí)促進(jìn)番茄株高和莖粗增長(zhǎng)，增量明顯高于對(duì)照組。從對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量的影響來看，殼寡糖鋅可提高番茄果實(shí)中可溶性固形物、還原糖、維生素C、鋅含量及固酸比。其中，鋅含量增加幅度最大，說明鋅元素被番茄植株有效吸收、利用，并在番茄果實(shí)中富集。同時(shí)，總酸含量降低，使番茄品質(zhì)和口感更佳。而且，施用殼寡糖鋅能夠明顯提高番茄總產(chǎn)量和一級(jí)果產(chǎn)量，降低二級(jí)果和次果產(chǎn)量。這與侯華民等[15]公開的含有機(jī)鋅的組合物（殼聚糖鋅或殼寡糖鋅等）對(duì)多種作物具有增產(chǎn)、改善品質(zhì)等作用相一致，且部分效果更優(yōu)。

綜上可知，殼寡糖鋅對(duì)抑制植物病原菌及對(duì)作物防病、增產(chǎn)等多方面具有明顯作用。本研究?jī)H初步探索了單獨(dú)、多次噴施殼寡糖鋅在溫室番茄上的良好應(yīng)用效果，但具體的作用機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，后續(xù)仍需在其他作物上推廣應(yīng)用，并根據(jù)作物不同生長(zhǎng)階段的營(yíng)養(yǎng)需求及病害防治情況，考察殼寡糖鋅單獨(dú)沖施及其與葉面肥、腐植酸水溶肥、氨基酸水溶肥、化藥等復(fù)配應(yīng)用的效果，明確殼寡糖鋅的施用方式和應(yīng)用范圍。

4 結(jié)論

殼寡糖和鋅在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有良好的應(yīng)用效果[24-30]，其中，殼寡糖作為一種植物免疫誘抗劑，對(duì)人、畜安全，長(zhǎng)期或多次使用不會(huì)使植物產(chǎn)生特異性抗藥性[31]。但二者分別存在速效性差、不易被吸收利用等弊端，降低了其本身所具有的良好功效。本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的殼寡糖鋅為真正的螯合產(chǎn)品，非殼寡糖與鋅元素的簡(jiǎn)單混配。產(chǎn)品中未引入氯離子、硫酸根離子、硝酸根離子，因此，作為殼寡糖的衍生物，殼寡糖鋅不僅施用更安全，對(duì)作物和土壤均無不良影響，而且功能更全面、功效更好，又高效地為作物提供了生長(zhǎng)必需的鋅元素。施用殼寡糖鋅可顯著提高作物體內(nèi)相關(guān)酶的活性，促進(jìn)作物光合作用和植株生長(zhǎng)，增強(qiáng)作物的抗病能力[32]，提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量[33-34]。與已有報(bào)道相似，如周林媛等[27]將殼寡糖與鎂鋅混配，可較好抑制煙草花葉病毒(TMV)侵染和提高煙株抗性。王士奎等[13]研究的寡聚酸合鋅(Ⅱ)對(duì)煙草病毒病具有較強(qiáng)的防治作用。

為探討殼寡糖鋅在田間的抗病、促生、增產(chǎn)等應(yīng)用可行性，本研究中，首先針對(duì)性地選擇了幾種常見的植物細(xì)菌性和真菌性病原菌，明確殼寡糖鋅的抑菌效果。研究證明，殼寡糖鋅對(duì)所選病原菌的抑菌效果均優(yōu)于市售對(duì)照藥劑，其中，對(duì)細(xì)菌性病原菌的抑菌優(yōu)勢(shì)明顯，MIC值較對(duì)照藥劑降低50%～75%。同時(shí)，MIC值僅為殼寡糖的1/2～1/4。其次，以溫室番茄為供試作物，跟蹤了殼寡糖鋅的田間應(yīng)用效果。結(jié)果表明，噴施殼寡糖鋅的番茄植株發(fā)病數(shù)量較對(duì)照組明顯減少，且病情較輕，即殼寡糖鋅對(duì)溫室番茄病害防效明顯。同時(shí)，殼寡糖鋅促使番茄株高和莖粗增長(zhǎng)17.11%和53.89%，番茄果實(shí)的可溶性固形物、還原糖、維生素C、鋅含量及固酸比分別增加5.88%、27.88%、51.60%、87.91%、11.90%。其中，鋅含量大幅增加，而番茄酸度降低了5.38%，使番茄品質(zhì)顯著提高，口感明顯提升。除此之外，番茄總產(chǎn)量和一級(jí)果產(chǎn)量分別增加23.35%和30.73%，顯著高于對(duì)照組，且無二級(jí)果和次果。

綜上所述，殼寡糖鋅抗菌譜廣，可有效防治番茄病害，促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)，提高番茄果實(shí)品質(zhì)和口感，增加產(chǎn)量。殼寡糖鋅兼具藥肥兩用的功效，且用量少、應(yīng)用成本低、安全環(huán)保、減藥（肥）增效，不易產(chǎn)生抗藥性，具有巨大的開發(fā)價(jià)值和市場(chǎng)前景。但仍需在作用機(jī)理及應(yīng)用的廣泛性方面做進(jìn)一步研究。