王俊，向健，熊麗

（1.天門市第一人民醫(yī)院檢驗科，湖北 天門431700；2.天門市第一人民醫(yī)院輸血科，湖北 天門431700；3.天門市第一人民醫(yī)院兒科，湖北 天門431700）

重型再生障礙性貧血（severe aplastic anemia，SAA）是由于造血干細胞受到損傷后引起的骨髓衰竭疾病，主要發(fā)病機制為自身免疫耐受失調(diào)、細胞免疫功能持續(xù)異常。CD4+CD25+T細胞是發(fā)生SAA最為重要的因子，同時，還屬于身體中較為特殊的T細胞亞群。T細胞具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，且可維持身體免疫平衡，抑制免疫反應(yīng)，因此，發(fā)生自身免疫性疾病時，存在T細胞功能及數(shù)量異常[1]。異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）和免疫抑制治療（immunosuppressive therapy，IST）是SAA最主要的兩種治療方法，對缺乏合適同胞供者SAA患者一線治療方案首選IST[2]。單獨應(yīng)用CsA治療SAA起效慢，治療后患者會出現(xiàn)牙齦增生、肝功能損傷、手震顫等不良反應(yīng)。ALG是一種對免疫活性細胞具有多種作用的多克隆抗淋巴細胞血清，屬于免疫調(diào)節(jié)劑，具有抑制和刺激淋巴細胞的雙重作用，能直接作用于造血祖細胞使之增殖分化。以ALG為主的免疫抑制綜合療法是目前除造血干細胞移植外治療SAA的主要方法，CsA聯(lián)合ALG治療SAA療效顯著，治療后，患者不良反應(yīng)少[3]。本研究旨在探討免疫抑制治療對小兒重型再生障礙性貧血CD4+CD25+T細胞及相關(guān)細胞因子表達的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2017年1月至2019年4月天門市第一人民醫(yī)院收治的重型再生障礙性貧血患兒74例，采用隨機數(shù)字表法分為研究組和對照組，每組37例。對照組男19例，女18例；年齡2～7歲，平均年齡（6.43±0.21）歲。研究組男21例，女16例；年齡3～8歲，平均年齡（6.56±0.33）歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。納入標(biāo)準：①入院后經(jīng)過醫(yī)師診斷、外周血象、骨髓涂片、活檢等確診；②患兒臨床資料完整，依從性較高；③符合《再生障礙性貧血診斷與治療中國專家共識（2017版）》[4]中關(guān)于重型再生障礙性貧血的診斷。排除標(biāo)準：①近6個月內(nèi)患兒使用過免疫抑制劑、皮質(zhì)類固醇激素；②患有心、肝、肺、腎等器官不全；③患有血液系統(tǒng)疾病。

1.2 方法

1.2.1 治療方法對照組給予環(huán)孢素A（Ciclosporin A，CsA；福建科瑞藥業(yè)有限公司，國藥準字H10930026，規(guī)格：50 mL∶5 g）治療，口服3～5 mg/（kg·d），分2次口服，連續(xù)治療6個月。研究組在對照組基礎(chǔ)上聯(lián)合抗淋巴細胞球蛋白（Antilymphocyte globulin，ALG；武漢生物制品研究所，國藥準字S20040023，規(guī)格：0.25 g/支）治療，將本品稀釋于250～500 mL氯化鈉注射液中（幼兒酌減稀釋用的氯化鈉注射液量），靜脈滴注，開始速度為每分鐘5～10滴，如10 min后無不良反應(yīng)，再逐漸加速，全量在1～2 h內(nèi)輸完。兩周1個療程，治療6個月后評價效果。

1.2.2 標(biāo)本采集與檢測空腹采集兩組外周EDTA抗凝靜脈血兩管（每管5 mL），肝素抗凝血一管（3 mL）備用。其中一支EDTA抗凝血管中加入5 mL RPMI1640液混勻，另一管EDTA抗凝靜脈血中加入5 mL淋巴細胞分離液，將上述混勻的全血加入分離液的上層，離心分離單個核細胞。調(diào)整細胞濃度為（5～10）×106/mL，取30μL細胞懸液于流式管中，分別加入CD4-FITC、CD25-PE單克隆抗體5μL，放入暗室表染30 min，染色緩沖液洗滌2次，加1%的多聚甲醛固定，用流式細胞儀[美國BD公司FACSCalibur流式細胞儀，同公司的試劑盒（批號：50028）]對CD4+T、CD25+T、CD4+CD25+T細胞進行檢測。采用ELISA法對肝素抗凝血進行血清IL-10、IL-35、TGF-β水平檢測。

1.3 觀察指標(biāo)①比較兩組治療6個月后CD4+CD25+T細胞和T淋巴細胞亞群表達。②比較兩組治療6個月后血清IL-10、IL-35、TGF-β水平。③比較兩組治療6個月后的治療效果。顯效：抑制與免疫反應(yīng)有關(guān)細胞的增殖和功能，降低機體免疫反應(yīng)，再生障礙性貧血情況有明顯好轉(zhuǎn)；有效：患兒抵抗能力提高，再生障礙性貧血正在逐漸好轉(zhuǎn)；無效：患兒再生障礙性貧血無改善，甚至疾病更加嚴重?？傆行?顯效率+有效率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗，計量資料以“±s”表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CD4+CD25+T細胞和T淋巴細胞亞群表達比較治療6個月后，研究組CD4+T、CD25+T、CD4+CD25+T、CD4+CD25+T/CD4+T均低于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組CD4+CD25+T細胞和T淋巴細胞亞群表達比較（±s，%）Table 1 Comparison of the expression of CD4+CD25+T cells and T lymphocyte subsets between the two groups(±s,%)

表1 兩組CD4+CD25+T細胞和T淋巴細胞亞群表達比較（±s，%）Table 1 Comparison of the expression of CD4+CD25+T cells and T lymphocyte subsets between the two groups(±s,%)

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2.2 兩組治療前后血清IL-10、IL-35、TGF-β水平比較治療后，研究組血清IL-10、IL-35、TGF-β水平均低于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組治療前后血清IL-10、IL-35、TGF-β水平比較（±s，ng/L）Table 2 Comparison of serum IL-10、IL-35 and TGF-βlevels between the two groups before and after treatment(±s,ng/L)

表2 兩組治療前后血清IL-10、IL-35、TGF-β水平比較（±s，ng/L）Table 2 Comparison of serum IL-10、IL-35 and TGF-βlevels between the two groups before and after treatment(±s,ng/L)

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2.3 兩組治療效果比較治療6個月后，研究組治療總有效率高于對照組（P＜0.05），見表3。

表3 兩組治療效果比較[n（%）]Table 3 Comparison of treatment effect between the two groups[n(%)]

3 討論

再生障礙性貧血屬于骨髓造血障礙性疾病，患者會出現(xiàn)骨髓容量減少及全血細胞減少情況，同時伴有出血、乏力和發(fā)燒等臨床癥狀，其發(fā)病與環(huán)境及飲食因素有關(guān)。有研究[5]指出SAA與患者自身CD4+T細胞功能亢進具有相關(guān)性，但目前其發(fā)病機制尚無明確定論。T淋巴細胞免疫功能的變化、表型、數(shù)量的變化與SAA具有關(guān)聯(lián)性，相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)SAA發(fā)病機制可能和Th具有一定關(guān)系，這是由于T淋巴細胞的免疫能力不斷被打破，r-IFN、IL-2、TNF-α等造血調(diào)控因子的分泌不斷增加所致[6]。由于CD4+CD25+T細胞可以根據(jù)免疫抑制作用抑制自身反應(yīng)性T細胞的活化，保持免疫平衡，當(dāng)發(fā)生自身免疫性疾病時，如特發(fā)性血小板減少性紫癜、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化病、I型糖尿病等，則會導(dǎo)致患者的CD4+CD25+T細胞功能和數(shù)量明顯降低[7]。

環(huán)孢素A是真菌的代謝產(chǎn)物，屬于環(huán)寡肽，可用于肝、腎、心臟等免疫系統(tǒng)引起的排異反應(yīng)。在治療再生障礙性貧血時，環(huán)孢素A能對免疫系統(tǒng)的排異反應(yīng)起到良好的中和效果。同時，環(huán)孢素A可選擇性抑制輔助T淋巴細胞，恢復(fù)T淋巴細胞亞群平衡，阻止炎癥因子合成與釋放，進而促進患者骨髓造血功能損傷程度降低，但單獨環(huán)孢素A治療具有可逆性?？沽馨图毎虻鞍讓儆诿庖咭种苿芍苯哟碳ぴ煅?祖細胞生長，改善骨髓造血功能，通過補體依賴的細胞溶解作用，促進T細胞凋亡，起到清除T細胞的目的。

本研究結(jié)果表示，治療后，研究組CD4+T、CD25+T、CD4+CD25+T、CD4+CD25+T/CD4+T均低于對照組（P＜0.05），表明在藥物聯(lián)合治療后患者的造血功能逐步恢復(fù)，CD4+CD25+T細胞水平逐步恢復(fù)正常，說明此細胞和重型再生障礙性貧血的發(fā)生密切相關(guān)。這可能是由于CD4+CD25+T細胞是通過分泌免疫調(diào)節(jié)因子不斷調(diào)節(jié)Th和T細胞群來控制自身的反應(yīng)性所致。當(dāng)患者機體中的CD4+CD25+T細胞比例發(fā)生失調(diào)后，相應(yīng)的細胞就會不斷減少，抑制IL-2的能力也會下降，機體免疫耐受作用隨之下降，機體中的活性T細胞出現(xiàn)繁殖，CD4+CD25+T細胞的比例會出現(xiàn)紊亂，機體的體液免疫隨之亢進，最終引起重型再生障礙性貧血的發(fā)生[8]。治療后，研究組患兒血清IL-10、IL-35、TGF-β水平均低于對照組（P＜0.05），這可能是由于CD4+T細胞的數(shù)量增加后，CD8+T、CD4+T細胞的比例出現(xiàn)失衡現(xiàn)象和免疫偏移等，從而促使造血微環(huán)境調(diào)節(jié)因子出現(xiàn)失衡。調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory cell，Treg）是一類具有顯著免疫抑制作用的CD4+T細胞亞群，血清IL-10、IL-35、TGF-β是Treg分泌的主要細胞因子，能抑制其他細胞的免疫應(yīng)答、減少炎性因子分泌，促使患者機體自身免疫耐受。當(dāng)發(fā)生SAA時，患者的Treg的功能和數(shù)量均發(fā)生異常，CD4+T細胞功能不能被抑制，而經(jīng)過免疫聯(lián)合治療后CD8+T、CD4+T細胞的比例逐漸平衡，CD4+T細胞功能，Treg的功能和數(shù)量逐步恢復(fù)正常，血清細胞因子隨之減少[9]。研究組治療總有效率高于對照組（P＜0.05），說明兩種藥物能發(fā)揮良好的協(xié)同作用，相互補充，促進藥效。這是因為CsA能有效抑制T細胞表達IL-2受體，抑制T淋巴細胞構(gòu)成，抑制負調(diào)節(jié)因子，從而恢復(fù)造血功能。而ALG能與淋巴細胞結(jié)合，在補體的共同作用下裂解淋巴細胞，從而抑制細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，提高免疫防護。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，ALG對造血干細胞的表面作用可幫助造血生長因子，提高敏感性，使造血功能更早恢復(fù)[10]。

綜上所述，在小兒重型再生障礙性貧血治療的過程中，免疫抑制治療效果較為理想，值得臨床推廣應(yīng)用。