張雅潔 劉云根 王妍 楊波

(云南省山地農(nóng)村生態(tài)環(huán)境演變與污染治理重點實驗室(西南林業(yè)大學(xué))，昆明，650224)

鈣是植物必需的礦質(zhì)營養(yǎng)元素，對植物的生長發(fā)育和生理活動起到關(guān)鍵性作用，在應(yīng)對環(huán)境脅迫中處于中心調(diào)控地位[1]。研究表明，鈣缺乏會導(dǎo)致植物在生長過程中出現(xiàn)某些生理活動紊亂和病害問題[2]，高鈣則會對植物的光合作用和生長發(fā)育產(chǎn)生影響，抑制呼吸作用，或者阻礙信號的傳導(dǎo)影響植物的正常發(fā)育，嚴重還會導(dǎo)致細胞器破裂致使植物死亡[3]。巖溶石漠化地區(qū)土壤鈣含量高，是一般地區(qū)土壤鈣的5～15倍[4]，大量植物因高鈣影響根系發(fā)育、代謝途徑、細胞結(jié)構(gòu)造成無法正常成長甚至死亡[5-7]，僅有少數(shù)耐鈣或喜鈣植物能正常生長[8]，因此在喀斯特石漠化生態(tài)恢復(fù)過程中，物種選擇至關(guān)重要。卷柏(Selaginellatamariscina)為多年生草本，是巖溶地區(qū)常見的先鋒植物，對各種極端惡劣環(huán)境有較強的適應(yīng)能力[9]，目前對卷柏的研究成果主要集中在其地上部分藥用價值方面，已知葉片中分離得到包括黃酮、生物堿、多糖、有機酸等物質(zhì)[10]。但鮮有關(guān)于卷柏生態(tài)適應(yīng)性以及對環(huán)境修復(fù)方面的報道。而根系分泌物是植物長期適應(yīng)外界環(huán)境而形成的一種適應(yīng)機制。在根系分泌物中，有機酸影響根際環(huán)境，在眾多的根系分泌物質(zhì)中作用最為重要，研究表明，根系分泌有機酸改變了土壤的理化性質(zhì)，以促進植物對所需養(yǎng)分的吸收[11]，并對植物的多種生理生態(tài)過程起到重要影響，調(diào)節(jié)植物對環(huán)境的適應(yīng)性，增強對不良環(huán)境的抗性，而根系對于土壤中的脅迫作用往往能做出反應(yīng)，因此探析植物根系分泌物對巖溶地區(qū)的高鈣環(huán)境的適應(yīng)性，對巖溶地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)和重建具有重要意義。本研究采用砂培方式測定不同鈣濃度條件下卷柏根系分泌有機酸種類和組成特征，探析巖溶地區(qū)典型先鋒植物卷柏對高鈣環(huán)境的適應(yīng)機制，以期為石漠化地區(qū)植被恢復(fù)提供理論參考和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

卷柏(S.tamariscina)，為蕨類卷柏科(Selaginellaceae)卷柏屬(Selaginella)卷柏的全草，多年生草本，又名長生不死草、九死還魂草、石蓮花等，是一類出現(xiàn)于中石炭世的原始而古老的蕨類植物[12]。卷柏分布廣泛，多生于向陽的山坡巖石上，或干旱的巖石縫中，該種既可觀賞，又有很高的藥用價值。本研究供試卷柏采集自云南省昆明市西山向陽坡巖溶山地，所采植株保證生長狀況、植株大小基本一致。

1.1 試驗設(shè)計與處理

試驗采用室內(nèi)模擬的方式進行，控制室溫在(25±1)℃。采用控制霍格蘭營養(yǎng)液中硝酸鈣(Ca(NO3)2)的方式配制成7種鈣梯度的營養(yǎng)液，硝酸鈣濃度分別為0、5、30、70、100、200、300 mmol·L-1，每種梯度設(shè)置5個重復(fù)，共35個處理。其中0 mmol·L-1的Ca2+模擬缺鈣環(huán)境，5 mmol·L-1用以模擬酸性土中交換態(tài)鈣平均濃度，100 mmol·L-1用以模擬石灰土中交換態(tài)鈣平均濃度，并將營養(yǎng)液pH值控制在6.0～6.5，一次性配制試驗期間所用營養(yǎng)液。培養(yǎng)基質(zhì)石英砂在植物移栽前先用水浸泡，后加入5%鹽酸浸泡24 h后用過量水沖洗至中性后裝盆晾干，以排除其它因素對實驗結(jié)果的影響。待植物生長正常后移栽植株，移栽過程中保證根系完整，清洗植株并作消毒處理，至石英砂環(huán)境下培養(yǎng)，每個鈣梯度設(shè)置5個平行處理，每盆1株植物。每天每盆施入100 mL營養(yǎng)液，保證各處理的施入量和施入時間一致。移栽30 d后統(tǒng)一收集卷柏根系分泌物，具體步驟如下：(1)將植物從石英砂中取出，用200 mL去離子水沖洗根部，通過雙層定性濾紙過濾，即得到根系分泌物的粗提物；(2)將粗提物加入V(分液漏斗)∶V(二氯甲烷)=1∶1萃取2次，合并萃取液；(3)萃取液放至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸發(fā)，減壓濃縮至干后用2 mL分析甲醇潤洗溶解有機相并過0.45 μm有機濾膜后裝入2 mL棕色液相瓶冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 測定方法

提取后的根系分泌物采用GC-MS(Agilent 7890A-5975C)測定。采用電子轟擊源，轟擊電壓70 eV，掃描范圍m/z30～600 amu，掃描速度0.2 s掃全程，離子源溫度230 ℃。毛細管柱：HP-5MS柱(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，柱溫50 ℃(2 min)，以6 ℃/min程序升溫至250 ℃(保持15 min)。載氣為He，流量1 mL/min。應(yīng)用NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，分析質(zhì)譜圖，確定各組分物質(zhì)名稱，并采用峰面積歸一化法計算各物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS17.0、Microsoft Excel 2010等軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖溶地區(qū)鈣對根系分泌有機酸種類的影響

在缺鈣條件下，卷柏根系分泌有機酸的種類最多，共有12種酸類物質(zhì)(表1)。當在有少量Ca2+出現(xiàn)的酸性土環(huán)境時，根系分泌有機酸的種類為9種。之后隨著鈣濃度增加卷柏根系分泌物中的有機酸種類逐漸減少，Ca2+濃度為30和70 mmol·L-1時，根系分泌有機酸種類相同為6種。當Ca2+濃度增加到100 mmol·L-1的石灰土環(huán)境時，共檢測出5種有機酸。之后當Ca2+濃度增加到200和300 mmol·L-1的高鈣環(huán)境時檢測出的有機酸種類分別為4種和3種。

在缺鈣環(huán)境下卷柏根系會產(chǎn)生更多種類的根系分泌有機酸，相比酸性土環(huán)境增加了3種。鈣濃度達到酸性土鈣含量后隨著鈣離子濃度的增加卷柏根系分泌有機酸的種類開始減少，5到30 mmol·L-1之間鈣濃度相差較小，但有機酸種類存在顯著差異，而30與70 mmol·L-1以及200與300 mmol·L-1之間雖鈣濃度跨度較大，但有機酸種類間沒有顯著差異。用以模擬缺鈣、酸性土、石灰土的0、5、100 mmol·L-13種梯度間有機酸種類均存在顯著差異。

表1 不同鈣脅迫對卷柏根系分泌有機酸種類的影響

2.2 巖溶地區(qū)不同鈣濃度條件下根系分泌有機酸特有成分

使用峰面積歸一化法計算不同鈣濃度條件下卷柏根系分泌的特有酸的質(zhì)量分數(shù)，從表2可以看出檢測出的特有酸都是低質(zhì)量分數(shù)有機酸。當在酸性土環(huán)境時，存在6種特有酸，花生酸(0.36%)、木蠟酸(0.21%)、山萮酸(0.17%)、正十七烷酸(0.10%)、亞油酸(0.55%)、棕櫚油酸(0.69%)。缺鈣條件下的特有酸種類最多，共鑒定9種，相比酸性土環(huán)境增加了肉豆蔻酸(0.13%)、正十五烷酸(0.09%)、3-(3,5-二叔丁基-4-羥基苯基)丙酸(0.06%)3種特有有機酸，這3種酸僅在缺鈣條件下分泌，是卷柏根系在缺鈣環(huán)境中分泌的特有性有機酸，此外，除正十七烷酸的質(zhì)量分數(shù)與在酸性土條件下相同外，其它幾種特有酸的質(zhì)量分數(shù)都有不同程度的增加。

當Ca2+濃度從酸性土環(huán)境增加到30 mmol·L-1時，木蠟酸、正十七烷酸、山萮酸消失，其它特有酸的質(zhì)量分數(shù)也相對降低。隨著鈣濃度升高，各類特有有機酸開始逐漸從組分中消失。當Ca2+濃度到達石灰土環(huán)境時，僅存在花生酸(0.11%)、亞油酸(0.15%)，當鈣濃度達到300 mmol·L-1時，特有酸全部消失。

表2 不同鈣脅迫對卷柏根系分泌有機酸特有酸類質(zhì)量分數(shù)的影響

2.3 巖溶地區(qū)鈣不同鈣濃度條件下卷柏根系分泌有機酸共有成分與分布特征

在7種不同鈣濃度環(huán)境下都出現(xiàn)的共有酸有3種，油酸、棕櫚酸及硬脂酸。油酸在酸性土環(huán)境下質(zhì)量分數(shù)為11.5%，在缺鈣環(huán)境下質(zhì)量分數(shù)陡然上升到31.21%。酸性土與石灰土環(huán)境下油酸的質(zhì)量分數(shù)也存在顯著差異，但相比缺鈣環(huán)境質(zhì)量分數(shù)的變化較為穩(wěn)定。棕櫚酸及硬脂酸在酸性土環(huán)境下的質(zhì)量分數(shù)分別為7.12%和2.15%，在缺鈣時質(zhì)量分數(shù)也出現(xiàn)了顯著性的增加，增加幅度小于油酸在相同環(huán)境間的變化幅度。在Ca2+濃度從酸性土環(huán)境逐漸向石灰土環(huán)境增加的過程中，油酸質(zhì)量分數(shù)在Ca2+濃度30至70 mmol·L-1之間變化較小，直到達到石灰土環(huán)境時才出現(xiàn)顯著差異；棕櫚酸質(zhì)量分數(shù)的變化則是當濃度達到70 mmol·L-1時就開始減緩；而硬脂酸相比其它兩種酸，在整個過程中都保持一個相對較緩、變化較小的規(guī)律。當Ca2+濃度達到酸性土環(huán)境后，相比之前Ca2+濃度梯度間的跨度增大，但3種酸的質(zhì)量分數(shù)的變化幅度一致變緩。油酸及硬脂酸在3個濃度間的質(zhì)量分數(shù)沒有顯著差異，棕櫚酸質(zhì)量分數(shù)在Ca2+濃度200 mmol·L-1后也開始沒有顯著性差異。

在缺鈣條件下，由于環(huán)境中缺鈣，根系分泌油酸、棕櫚酸及硬脂酸都顯著高于酸性土環(huán)境。Ca2+濃度在酸性土到石灰土環(huán)境區(qū)間內(nèi)，隨著鈣濃度的升高對植物根系分泌有機酸產(chǎn)生了抑制作用，3種酸的質(zhì)量分數(shù)開始持續(xù)降低，在每個梯度之間都存在一定的顯著差異。直到Ca2+濃度達到石灰土環(huán)境后，3種酸的質(zhì)量分數(shù)變化開始趨于穩(wěn)定，Ca2+的增加幅度加大，但3種酸類的質(zhì)量分數(shù)沒有顯著差異，基本穩(wěn)定在一個相近的數(shù)值內(nèi)。

在7種Ca2+濃度梯度下，油酸的質(zhì)量分數(shù)始終比其它兩種酸更大，尤其在缺鈣環(huán)境下植物分泌大量的油酸。酸性土環(huán)境時硬脂酸質(zhì)量分數(shù)較棕櫚酸和油酸的質(zhì)量分數(shù)較小，油酸質(zhì)量分數(shù)顯著大于棕櫚酸質(zhì)量分數(shù)。在Ca2+濃度達到石灰土環(huán)境的過程中，3種酸都有不同程度的降低，3種酸的質(zhì)量分數(shù)開始慢慢接近，Ca2+濃度達到石灰土環(huán)境時，硬脂酸質(zhì)量分數(shù)依然相比其它兩種酸較小，但油酸與棕櫚酸之間的質(zhì)量分數(shù)非常接近。之后隨著鈣濃度繼續(xù)大幅增加，3種酸質(zhì)量分數(shù)的差值繼續(xù)減小，當鈣離子濃度到達300 mmol·L-1時3種酸的質(zhì)量分數(shù)之間的差值達到最小?？梢钥闯?，在高鈣環(huán)境時，棕櫚酸、油酸和硬脂酸的質(zhì)量分數(shù)不再隨著鈣濃度的增加出現(xiàn)較大變化，且都穩(wěn)定保持在一個較低但相對接近的濃度(表3)。

表3 不同鈣脅迫對卷柏根系分泌有機酸共有酸質(zhì)量分數(shù)的影響

3 結(jié)論與討論

目前，關(guān)于根系分泌有機酸的相關(guān)研究主要集中在農(nóng)作物、經(jīng)濟林木、草本植物和濕地植物，關(guān)于蕨類植物根系分泌有機酸的研究較少。而不同植物根系分泌有機酸的種類和分泌量也不同，通過此次研究得到了蕨類植物卷柏根系中穩(wěn)定分泌的有機酸為棕櫚酸、油酸、硬脂酸，隨著環(huán)境中的鈣濃度變化這3種有機酸始終穩(wěn)定存在，且有相對較高的含量。根系是植物對土壤環(huán)境反應(yīng)最敏感的部位，在植物受到環(huán)境影響時植物根系往往最先做出反應(yīng)，而根系分泌物是植物根系對土壤環(huán)境生化適應(yīng)的產(chǎn)物，植物在生長過程中，根系從環(huán)境中攝取養(yǎng)分的同時，也向環(huán)境中釋放大量有機物，任何影響植物生長和生理的因素均會影響根分泌物的數(shù)量和種類[13-14]。已有研究表明，在養(yǎng)分缺乏的情況下，植物根系通過增加根系分泌有機酸的含量來應(yīng)對，如缺磷環(huán)境下的構(gòu)樹、桑樹、諸葛菜和油菜根系分泌有機酸的總量都增加[15]；缺鐵導(dǎo)致鷹嘴豆根系分泌有機酸增加5～10倍[16]；缺鋅促進了蘋果有機酸向地下部的分配，根和莖中草酸和蘋果酸的濃度提高了1.09～1.35倍，有機酸向根系的分配比例增加[17]。本研究的結(jié)果也驗證了這一觀點：鈣作為植物生長中不可或缺的營養(yǎng)元素，在鈣元素缺乏的情況下，卷柏通過增加根系分泌有機酸含量和種類，增加了肉豆蔻酸、正十五烷酸、3-(3,5-二叔丁基-4-羥基苯基)丙酸這3種缺鈣脅迫下產(chǎn)生的特有酸，以及提高棕櫚酸、油酸、硬脂酸3種共有有機酸的含量，即產(chǎn)生誘增有機酸來減輕逆境環(huán)境對植物的影響，促進植物對養(yǎng)分的吸收和利用，增加植物適應(yīng)性以及保護植物的細胞膜系統(tǒng)[18]。所以在鈣濃度為0 mmol·L-1條件下，由于根際環(huán)境缺鈣卷柏根系開始分泌多種特有的低濃度有機酸，以及其它共有酸的質(zhì)量分數(shù)也明顯提高，這可能是卷柏應(yīng)對營養(yǎng)元素缺乏時根系做出的適應(yīng)機制，通過提高根系分泌有機酸的種類以及含量來提高植物抗性，保護養(yǎng)分缺乏對植物細胞膜系統(tǒng)的破壞。其中油酸質(zhì)量分數(shù)的增加尤為顯著，而油酸作為一種單不飽和脂肪酸，對植物響應(yīng)多種非生物環(huán)境影響具有多重調(diào)節(jié)功能[19]，缺鈣時卷柏分泌的大量油酸可能也對植物起到了重要的調(diào)節(jié)作用。

目前就高鈣條件對植物根系分泌物的影響的研究尚未見報道，在本研究中，以5 mmol·L-1鈣濃度模擬酸性土，100 mmol·L-1鈣濃度模擬石灰土，從酸性土到石灰土，隨著鈣濃度的增加，植物根系分泌有機酸的種類逐漸減少，各酸類的質(zhì)量分數(shù)也有顯著降低。這是因為鈣離子對植物的生長和生理產(chǎn)生了影響，抑制了根系對有機酸的分泌，從而導(dǎo)致根系分泌有機酸的種類和含量產(chǎn)生了變化。而當鈣濃度達到石灰土的高鈣環(huán)境后，鈣離子的增加幅度變大，但根系分泌共有有機酸棕櫚酸、油酸、硬脂酸的質(zhì)量分數(shù)開始趨于穩(wěn)定，不再隨鈣離子濃度的變化而產(chǎn)生較大變化，且3種酸的質(zhì)量分數(shù)也保持在相似的數(shù)值。相關(guān)研究表明，天然脂肪酸類物質(zhì)在防治植物病害、調(diào)節(jié)植物生理生態(tài)和生長發(fā)育以及改善土壤的理化性質(zhì)方面有著很高的價值[20]。棕櫚酸和油酸明顯影響了植物的生理代謝，促進了植物的生長發(fā)育，兩種脂肪酸提高了土壤中的酶活性，促進土壤中有機養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，并且明顯降低土壤中真菌的數(shù)量[21]。這可能是卷柏能在高鈣的巖溶地區(qū)生存的原因，在面對極端逆境的高鈣情況下，卷柏根系分泌的棕櫚酸和油酸兩種脂肪酸能保持在一個較穩(wěn)定的狀態(tài)，調(diào)節(jié)卷柏在逆境中的生理活動，但脂肪酸促進卷柏抵抗高鈣環(huán)境的具體作用機理還有待進一步的研究。

綜上所述，從植物抗逆性的角度考慮，卷柏能夠在高鈣環(huán)境的石灰土上正常生存的原因在于：當根際土壤處于高鈣條件時，卷柏能夠保持棕櫚酸、硬脂酸、油酸3種共有酸相對穩(wěn)定的分泌量，較穩(wěn)定的有機酸含量為卷柏維護了根際環(huán)境的相對穩(wěn)定。

實驗設(shè)計Ca2+營養(yǎng)液7個濃度梯度上，卷柏根系分泌有機酸中的穩(wěn)定成分有棕櫚酸、油酸和硬脂酸，3種酸在所有濃度梯度上都具有相對穩(wěn)定的含量，且在高濃度梯度環(huán)境下不具有顯著性變化；在缺鈣條件下，植物根系分泌有機酸種類增加，出現(xiàn)了多種僅在此濃度梯度下存在的特有酸，且3種共有酸成分的質(zhì)量分數(shù)都明顯增加；高鈣環(huán)境下，根系分泌有機酸的種類相比低鈣條件下降低，低鈣脅迫下的特有酸逐漸消失，但3種共有有機酸保持在一定穩(wěn)定水平，且鈣濃度越高3種穩(wěn)定根系分泌有機酸的質(zhì)量分數(shù)越趨于一個穩(wěn)定值。