呂運(yùn)舟 董筱昀 梁珍海 孫海楠 黃利斌 蔣澤平

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，南京，211153)

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛參與植物次生代謝、細(xì)胞分化、抗逆性等生理生化過(guò)程，其成員都具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由52個(gè)氨基酸構(gòu)成的重復(fù)基序組成[1-3]。根據(jù)重復(fù)基序數(shù)目(R)可以分為1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB4種類型[3]。目前，MYB轉(zhuǎn)錄因子已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)等模式物種中得到分離和功能鑒定[2-3]，在毛果楊(Populustrichocarpa)[4]、杉木(Cunninghamialanceolata)[5]、楠木(Phoebezhennan)[6]、桑樹(shù)(Morusnotabilis)[7]等喬木樹(shù)種基因組或轉(zhuǎn)錄組水平得到鑒定。

植物葉片顏色是由葉片中色素的組分、含量及分布決定[8-9]，包括葉綠素、類黃酮類和類胡蘿卜素類色素。類黃酮類色素和類胡蘿卜素的種類和含量決定了植物界的繽紛色彩，許多研究結(jié)果已經(jīng)揭示了它們的生物合成過(guò)程[10]。MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)黃酮類化合物和類胡蘿卜素的生物合成起到重要的調(diào)控作用，如擬南芥MYB基因家族的MYB11[11]、MYB12[12-13]、MYB112[14]通過(guò)調(diào)控CHS、CHI、F3H和FLS1基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)花青素等類黃酮類化合物生物合成的調(diào)控作用；彩艷龍頭花(Mimuluslewisii)R2R3-MYB類基因RCP1可以激活所有類蘿卜素合成基因而激活花瓣中類胡蘿卜素的生物合成[15]。此外，Amponmah et al.[16]發(fā)現(xiàn)獼猴桃(Actinidiadeliciosa)MYB7基因在轉(zhuǎn)錄水平正向調(diào)控類胡蘿卜素和葉綠素的生物合成。葉色變異植株是彩葉新品種和植物色素合成功能基因組學(xué)研究的重要材料[9，17]?！鹧娌蕶琛?Koelreuteriabipinnata‘Jinyan’)是黃山欒樹(shù)(Koelreuteriabipinnatavar.integrifoliola)的天然黃化突變體，枝干呈橙黃色，春季葉片橙紅色，秋季全株葉片金黃，具有極高的觀賞價(jià)值[18-19]。本研究以‘金焰彩欒’及其原種黃山欒樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)入手，結(jié)合葉片發(fā)育不同時(shí)期高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，挖掘鑒定黃山欒樹(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子家族基因，并對(duì)其預(yù)測(cè)蛋白特征及表達(dá)特征進(jìn)行比較分析，旨在鑒別與類黃酮類或類胡蘿卜素調(diào)控相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子，探討‘金焰彩欒’葉片呈色的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試黃山欒樹(shù)及其黃葉變異株‘金焰彩欒’種植于江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)苗圃內(nèi)。

1.2 RNA提取、cDNA文庫(kù)建立及測(cè)序

分別從固定樣株中采集春季新葉、夏季成熟葉及秋季變色期葉片，分別為T(mén)1(‘金焰彩欒’秋季葉片)、T2(實(shí)生對(duì)照秋季葉片)、T3(‘金焰彩欒’春季葉片)、T4(實(shí)生對(duì)照春季葉片)、T5(‘金焰彩欒’夏季葉片)及T6(實(shí)生對(duì)照夏季葉片)，液氮速凍；總RNA按照Trizol試劑盒(Thermo Fisher,USA)提取，測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成，使用Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序[17]。

1.3 MYB基因鑒定

利用pfam數(shù)據(jù)庫(kù)PFAM(http://pfam.xfam.org/)的MYB基因家族結(jié)構(gòu)域hmmer隱馬爾科夫模型文件(PF00249)及hmmsearch軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中所有的蛋白序列進(jìn)行搜索，篩選期望值<0.001為候選基因家族基因；手動(dòng)確認(rèn)候選基因中的結(jié)構(gòu)域序列,利用關(guān)鍵“MYB”進(jìn)行檢索，結(jié)合NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)工具，刪除不含MYB結(jié)構(gòu)域或重復(fù)序列。

1.4 蛋白序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR(https://www.arabidopsis.org/)下載模式植物擬南芥的MYB基因蛋白序列。提交MYB蛋白序列至ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)，ProtParam在線分析蛋白序列性質(zhì)。利用多序列比對(duì)軟件muscle 3.8.31對(duì)97個(gè)黃山欒樹(shù)和130個(gè)擬南芥MYB蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析，然后用軟件MEGA7.0構(gòu)建鄰接法(neighbor joining，NJ)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，使用p-distance距離模型構(gòu)建，選擇成對(duì)刪除選項(xiàng)，bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.5 表達(dá)特征分析及驗(yàn)證

利用97個(gè)MYB候選基因在黃山欒樹(shù)轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，包括‘金焰彩欒’和普通黃山欒樹(shù)的3個(gè)時(shí)期(春季新葉、夏季成熟葉和秋季衰老葉)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)FPKM[20]進(jìn)行歸一化轉(zhuǎn)換，然后繪制熱圖。

此外，選取10個(gè)與類黃酮類及苯丙氨酸類化合物代謝調(diào)控相關(guān)的MYB候選基因，選用看家基因KbGAPDH為內(nèi)參[21]。定量PCR引物利用Premier 5在非保守域設(shè)計(jì)，引物信息參見(jiàn)表1；RNB100 RNA提取試劑盒(SIGMA)提取以上6個(gè)組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA稀釋10倍，使用SYBR Premix Ex TaqTM(TAKARA)定量試劑盒，在CFX-96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)上進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，cDNA模板1.0 μL，并加6.4 μL ddH2O，每個(gè)樣本3次重復(fù)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 用于定量分析的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果

經(jīng)過(guò)測(cè)序質(zhì)量控制，共得到31.44 Gb有效數(shù)據(jù)，各樣品Q30堿基百分比均不小于90.74%。經(jīng)Trinity軟件組裝后，共得到175 881條轉(zhuǎn)錄本和94 125條單基因簇，轉(zhuǎn)錄本與單基因簇的N50分別為2 791和1 340，組裝完整性較高。生物學(xué)分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)，共有47 341條單基因簇在與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)得到注釋，這些序列信息為后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

2.2 黃山欒樹(shù)MYB基因家族的鑒定及編碼蛋白

基于黃山欒樹(shù)及其突變體葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的本地Blast比對(duì)檢索，在NR、NT、Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋，再經(jīng)NCBI CDD工具檢驗(yàn)，去除過(guò)短和重復(fù)冗余的序列后，共獲得97個(gè)黃山欒樹(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子，分別命名為KbMYB1～KbMYB97。從表2可以看出，包括48個(gè)1R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子，47個(gè)R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子和2個(gè)3R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子得到鑒定，預(yù)測(cè)編碼蛋白長(zhǎng)度介于52(KbMYB89)～1780KbMYB25)個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量大小介于52.0～193.35 ku，理論等電點(diǎn)范圍在4.51(KbMYB16)～11.87(KbMYB51)。

2.3 黃山欒樹(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化分析

利用MEGA7.0構(gòu)建的黃山欒樹(shù)與擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如圖1所示，可以分為23亞組，亞組G23僅包含22個(gè)黃山欒樹(shù)轉(zhuǎn)錄因子，亞組G3、G6和G21僅包含擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子。19個(gè)亞組由黃山欒樹(shù)和擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子共同組成，其中亞家族G2、G9、G14中只有1個(gè)黃山欒樹(shù)MYB基因家族成員。此外，在同一亞組中擬南芥基因和黃山欒樹(shù)基因之間彼此相互分開(kāi)，說(shuō)明兩者遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。已有研究表明親緣關(guān)系較近的MYB轉(zhuǎn)錄因子具有相似生物學(xué)功能[2-3]，基于擬南芥中的研究，G1、G2、G4、G7、G8、G9和G13分別與次生生長(zhǎng)、生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答等調(diào)控有關(guān)。

表2 黃山欒樹(shù)MYB基因家族編碼蛋白信息

圖1 黃山欒樹(shù)和擬南芥MYB類蛋白家族的進(jìn)化分析

2.4 MYB轉(zhuǎn)錄因子在‘金焰彩欒’葉片呈色過(guò)程中的表達(dá)模式

利用黃山欒樹(shù)及其黃葉突變體‘金焰彩欒’春、夏、秋3個(gè)時(shí)期的葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，提取97個(gè)MYB基因?qū)?yīng)的RPKM值(代表每百萬(wàn)片段中來(lái)自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的片段數(shù))，并經(jīng)歸一化處理制作Heml熱圖(如圖2所示)。結(jié)果表明，MYB基因在‘金焰彩欒’及普通黃山欒樹(shù)不同時(shí)期葉片中表達(dá)差異明顯。根據(jù)表達(dá)模式特征可以將黃山欒樹(shù)MYB基因家族成員分為4類，I～I(xiàn)II類在‘金焰彩欒’和普通欒樹(shù)中表達(dá)模式基本一致，其中I組為春季葉片中表達(dá)豐度較少，在夏季上調(diào)表達(dá)，秋季又下調(diào)表達(dá)；II組為春季和夏季葉片中表達(dá)量較少，在秋季上調(diào)表達(dá)；III組為春季葉片中表達(dá)豐度較高，在夏季和秋季葉片中表達(dá)下調(diào)。而IV組中的MYB基因在‘金焰彩欒’的3個(gè)時(shí)期葉片中表達(dá)量均較高，而在對(duì)照中呈現(xiàn)春季葉片表達(dá)豐度較高，其它兩個(gè)時(shí)期較低，這些MYB基因可能參與調(diào)控突變體葉片呈色過(guò)程。

2.5 類黃酮類等次盛化合物合成調(diào)控候選MYB基因表達(dá)

根據(jù)MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)特征及聚類分析結(jié)果，挑選與擬南芥類黃酮類、苯丙烷類等次生代謝合成調(diào)控相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白同源性較近的10個(gè)黃山欒樹(shù)MYB候選基因。實(shí)時(shí)定量分析結(jié)果表明(表3)，春季葉片相對(duì)高表達(dá)的MYB轉(zhuǎn)錄因子包括KbMYB40，KbMYB65，KbMYB80和KbMYB91，其中KbMYB80在‘金焰彩欒’表達(dá)量相對(duì)較高，而KbMYB40相反。候選基因KbMYB6和KbMYB8，預(yù)測(cè)與花青素等類黃酮類化合物合成正向調(diào)控相關(guān)，表達(dá)模式一致，在普通欒樹(shù)夏季成熟葉中表達(dá)較高，秋季表達(dá)下降?；ㄇ嗨睾铣韶?fù)向調(diào)控候選基因KbMYB60在供試樣本中表達(dá)量較為一致，呈高水平狀態(tài)。而苯丙烷類合成調(diào)控候選基因KbMYB88在‘金焰彩欒’和普通欒樹(shù)的春、秋時(shí)期葉片中表達(dá)基本一致，在夏季葉片中表達(dá)量增加，且在普通欒樹(shù)中表達(dá)量最高。

T1、T3、T5與T2、T4、T6分別為‘金焰彩欒’與對(duì)照的秋季、春季及夏季葉片。

3 結(jié)論與討論

黃山欒樹(shù)是我國(guó)優(yōu)良的鄉(xiāng)土樹(shù)種，具有多種經(jīng)濟(jì)價(jià)值和園林觀賞價(jià)值，是園林綠化、庭院配植的理想樹(shù)種[18]。MYB轉(zhuǎn)錄因子在類黃酮類、類蘿卜素及苯丙烷類化合物代謝調(diào)控關(guān)系密切，在植物葉片、花瓣及果實(shí)呈色調(diào)控中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[22-26]。通過(guò)對(duì)黃山欒樹(shù)葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘，共鑒定出97個(gè)MYB基因，預(yù)測(cè)編碼蛋白長(zhǎng)度介于52～1 780個(gè)氨基酸。通過(guò)與130個(gè)擬南芥MYB(AtMYB)蛋白聚類分析，預(yù)測(cè)到多個(gè)MYB基因可能參與類黃酮類、類胡蘿卜素類和苯丙烷類化合物代謝通路功能基因表達(dá)調(diào)控。Dubos et al.[3]根據(jù)結(jié)構(gòu)及功能將擬南芥MYB基因家族分為27個(gè)亞家族，其中AtMYB11、AtMYB12與AtMYB112[11-14]；AtMYB75[27]、AtMYB90[3]與AtMYB123[28]分別參與黃酮和花青素生物合成過(guò)程。共有13個(gè)黃山欒樹(shù)MYB基因與它們歸為4個(gè)亞組(G1、G2與G4)，涉及KbMYB5、KbMYB9、KbMYB80、KbMYB91，KbMYB6、KbMYB8、KbMYB44、KbMYB79、KbMYB93與KbMYB74、KbMYB40、KbMYB65，它們可能參與黃酮和花青素的生物合成調(diào)控。AtMYB58、AtMYB63[29]，AtMYB46[30]和AtMYB72[30]參與苯丙烷類化合物代謝而影響植物次生細(xì)胞壁合成，間接影響黃酮類代謝通路。由此推測(cè)，KbMYB16和KbMYB88參與黃山欒樹(shù)葉片細(xì)胞次生壁合成過(guò)程。

表3 候選MYB基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析

‘金焰彩欒’是黃山欒樹(shù)實(shí)生變異的黃化突變體，觀賞價(jià)值極高[18]。研究發(fā)現(xiàn)，金焰彩欒’整個(gè)生長(zhǎng)期中的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量和類胡蘿卜素、花色素苷含量均顯著低于原種，其光合能力減弱，生長(zhǎng)較原種受到部分影響[19]。此外，研究發(fā)現(xiàn)脫落醛氧化酶基因的下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致了類胡蘿卜素含量降低，葉綠素a酸酯氧化酶基因的下調(diào)表達(dá)與葉綠體合成受阻有關(guān)[17]，而在功能酶轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控上也存在差異。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，有25個(gè)MYB基因在春季葉片中表達(dá)較高，有21個(gè)在‘金焰彩欒’春、夏、秋葉片中表達(dá)量均高于普通欒樹(shù)，這些基因可能參與了‘金焰彩欒’葉片呈色調(diào)控。過(guò)表達(dá)AtMYB60可以抑制植物花青素生物合成[31-32]，KbMYB60與其進(jìn)化關(guān)系最近，且在‘金焰彩欒’各時(shí)期葉片中表達(dá)均較高，預(yù)測(cè)其參與了花青素生物合成的負(fù)調(diào)控。進(jìn)一步驗(yàn)證此類MYB基因功能，有助于揭示‘金焰彩欒’葉片變異的調(diào)控機(jī)理，為后續(xù)彩葉植物新品種開(kāi)發(fā)提供分子基礎(chǔ)。