何 磊，張乃方，程 磊，陳 欣

（浙江大學(xué)a.國家級生物實驗教學(xué)示范中心；b.生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310058）

0 引言

土壤微生物在陸地生態(tài)系統(tǒng)有機質(zhì)的分解、物質(zhì)循環(huán)及土壤結(jié)構(gòu)的保持等方面具有其重要的作用［1-6］。溫度變化會影響土壤微生物活性，溫度升高促進了微生物呼吸等代謝過程，提高了微生物的活性；另一方面，土壤微生物活性也會對氣候變化產(chǎn)生正反饋作用［7-9］，微生物活性的提高會促進熱量的產(chǎn)生，加劇土壤溫度的升高，一些不易分解的碳在升溫的作用下成為較易分解的碳，從而促進微生物對有機碳的分解［10］。因此，了解微生物群落的多樣性對于氣候變化的響應(yīng)具有十分重要的意義。

土壤微生物群落具有多樣性高且大部分不能單獨純培養(yǎng)的特點［11-12］，近年來，科研工作者越來越多地使用分子生物學(xué)方法進行微生物多樣性的研究［13-15］。微生物rRNA具有很高的保守性，能夠反映微生物之間的親緣關(guān)系；同時，也具有一定的變異性，通過核酸序列特征能夠鑒別不同的微生物種類。原核微生物的rRNA按照沉降系數(shù)可分為5S、16S和23S rRNA，由于16S rRNA的長短適中并同時含有保守區(qū)和變異區(qū)，因此是很好的生物標(biāo)志物。由于傳統(tǒng)一代測序的數(shù)據(jù)通量過小，無法測出環(huán)境樣品中龐大數(shù)量的微生物，目前，與16S rRNA擴增結(jié)合的高通量測序手段成為了研究微生物多樣性的重要方法之一。

本文從微生物生態(tài)學(xué)科研中提煉出一個生態(tài)學(xué)科研訓(xùn)練實驗——土壤微生物多樣性的分子生物學(xué)測定，該實驗先提取土壤中微生物的基因組DNA，利用微生物16S基因特定區(qū)域的通用引物對16S rRNA進行擴增，再對PCR產(chǎn)物進行純化和質(zhì)量測定，最后用Illumina測序儀進行高通量二代測序。該實驗用于多年的實驗教學(xué)實踐，大大激發(fā)了學(xué)生探索科學(xué)的欲望，提高學(xué)生綜合實驗?zāi)芰?，為學(xué)生日后進行相關(guān)科學(xué)研究夯實基礎(chǔ)。

1 實驗材料與儀器設(shè)備

1.1 實驗材料

MP FastDNA SPIN Kit for DNA試劑盒（MO BIO laboratories，Inc.，Carlsbad，CA，USA），Bioflux 切膠回收試劑盒（Bioer Technology Co.，Ltd，Hangzhou，CHN），15 mL離心管，2 mL離心管，槍頭，TAE電泳緩沖液，10 ×Taq 酶buffer，2.5 mmol／L dNTPs，Taq 酶。

1.2 儀器設(shè)備

天平，離心機（Eppendorf，Centrifuge 5424），PCR儀（Eppendorf，nexus SX1），移液器，電泳儀（BIORAD，Power Pac Basic），微量紫外-可見光分光光度計（Nanodrop，ND LITE Spectrophotometer，Thermo Fisher Scientific Inc.，Wilmington，DE，USA），切膠儀（上海培清，JS-BLUE 350E）。

2 實驗內(nèi)容與步驟

實驗土壤取于升溫實驗基地，實驗基地包括兩個處理，一個是對照處理；另一個是土壤升溫處理，升溫處理的樣地使用紅外線加熱器來為土壤增溫，懸掛高度約為1.5 m，對照處理樣地在同樣的位置懸掛一個假的加熱器。據(jù)溫度測定結(jié)果，空氣日均溫度增加了1.27℃，而土壤日均溫度增加了1.71℃。分別在每個處理點內(nèi)隨機選取3個采樣點，使用土壤柱狀取樣器收集0～10 cm的表層土以及10～20 cm的底層土，將土壤裝入密封袋后低溫保存待用。

2.1 穩(wěn)定同位素探針（SIP）實驗

為了研究升溫對微生物群落以及分解作用的影響，設(shè)計了一個室內(nèi)培養(yǎng)實驗。首先，將不同處理的土壤分成若干個20 g干重的小份，然后統(tǒng)一調(diào)整其濕度至60%，放入165 mL的廣口瓶中。之后，將不同處理中的其中一瓶作為對照，其余廣口瓶中加入碳十三標(biāo)記的小麥（Trticum aestivum，13C含量＞97%，IsoLife BV，Wageningen，The Netherlands）植物材料并混合均勻，植物材料和土壤的質(zhì)量比為1∶150。將培養(yǎng)瓶遮光并在25℃的溫度下培養(yǎng)9個星期。培養(yǎng)實驗結(jié)束后取土壤進行DNA提取和后續(xù)13C-DNA的分離及測序。

2.2 土壤中DNA的提取與測定

（1）稱取500 mg土壤，加入MP Fast DNA SPIN Kit for DNA 試劑盒（MO BIO laboratories，Inc.，Carlsbad，CA，USA）中的Lysing Matrix E Tube，再加入978 μL Sodium Phosphate Buffer和122 μL MT Buffer，混勻40 s。

（2）設(shè)置離心機轉(zhuǎn)速為14 000 g，離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的干凈的2 mL離心管，加入250 μL PPS并用槍頭吹打均勻，用手上下?lián)u10次。

“互聯(lián)網(wǎng)+”的應(yīng)用讓人們的整個生活發(fā)生了很大的改變，包括人們的出行方式，支付方式，都在逐步地走向便捷，當(dāng)然也包括我們的學(xué)習(xí)方式，從以前的書籍到現(xiàn)在的電子版，從以前的當(dāng)面授課到現(xiàn)在的視頻直播，都在發(fā)生著悄悄地改變，而且這種改變對我們來說是有益的，也是值得提倡的[3]。下面就介紹現(xiàn)在幾種常見的教學(xué)方法。

（3）設(shè)置離心機轉(zhuǎn)速為14 000 g，離心5 min，小心吸取上清液至干凈的15 mL離心管中，加入1 mL Binding Matrix Suspension（用之前要將其搖晃重懸），手工反轉(zhuǎn)2 min，然后將管子靜置3 min。

（4）小心去除500 μL上清液，避免碰到沉淀。將剩下的液體重懸，將其中的600 μL轉(zhuǎn)移到SPIN Filter中，以14 000 g的轉(zhuǎn)速離心1 min，將Catch Tube倒空，再將剩下的混合物加到SPIN Filter中，以同樣的轉(zhuǎn)速離心1 min。

（5）添加500 μL SEWS-M 到SPIN Filter并把其中的混合物用槍頭輕柔地重懸，以14 000 g的轉(zhuǎn)速離心1 min，倒出流過液并把SPIN Filter放回Catch Tube。以14 000 g的轉(zhuǎn)速再離心2 min，清干SPIN Filter中剩余的SEWS-M。

（6）移動SPIN Filter到新的Catch Tube上，打開蓋子，室溫風(fēng)干5 min。

（7）加入40 μL無菌水輕輕重懸，用槍頭輕輕攪動或用手指輕彈。

（8）以14 000 g的轉(zhuǎn)速離心1 min，DNA被洗脫到Catch Tube中。

（9）取1.5 μL DNA 溶液用微量紫外-可見光分光光度計測定DNA的濃度與質(zhì)量，當(dāng)OD260／OD280在1.7～2.0之間（純度較好的DNA 該比值在1.8附近），可以進行之后的步驟。

2.3 16S rRNA擴增與檢測

（2）PCR擴增。PCR程序為：94℃ 5 min，30個循環(huán)×（94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min），72℃ 10 min。

（3）取1 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳以驗證DNA序列是否擴增成功。稱取2 g瓊脂糖，與100 mL TAE緩沖液混合，加熱后再混入染料，使其凝固制成凝膠，之后將DNA樣品與Loading buffer以1∶5的比例混合，加入點樣孔，進行電泳。在目標(biāo)區(qū)域看到明顯的條帶說明成功進行PCR擴增（見圖1）。

圖1 成功擴增DNA片段的電泳圖示例（紅色方框內(nèi)為符合目標(biāo)片段長度的DNA）

2.4 Illumina MiSeq測序

使用干凈的刀片，對符合目標(biāo)序列長度的PCR產(chǎn)物進行切膠分離，并且使用切膠回收試劑盒（Bioer Technology Co.，Ltd，Hangzhou，CHN）溶出DNA。經(jīng)微量紫外-可見光分光光度計驗證其濃度與純度后，將樣品混合，使用Illumina測序儀上機測序。

2.5 454焦磷酸測序

對于SIP實驗分離出的13C-DNA以及不含標(biāo)記的DNA組分，使用針對16S序列V4-V8區(qū)的F515（5′-TCGTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和 R1391（5′-AGACGGGCGGTGTGTRCA-3′）進行16S 擴增。其中F和R引物上都帶有8位堿基的barcode和測序需要的linker，每個樣品設(shè)有3個技術(shù)重復(fù)。100 μL的PCR體系包括AccuPrime Tag DNA聚合酶（Invitrogen，Carlsband，CA）3 個單位，10 × PCR buffer 10 μL，50 mmol／L MgSO410 μL，2.5 mmol／L dNTP（Invitrogen）8 μL，BSA（New England BioLabs，Ipswich，MA）0.5 μL，F(xiàn) 和R 引物各0.2 μmol／L，以及模板DNA5 ng，其余加無菌去離子水。PCR程序為：94℃ 2 min，25個循環(huán)×（94 ℃30 s，56 ℃30 s，68 ℃ 45 s），68 ℃10 min。PCR產(chǎn)物通過切膠回收和濃度純度測定之后進行454焦磷酸測序。

2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

（1）本實驗中主要利用QIIME軟件對數(shù)據(jù)進行后續(xù)處理：首先對數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制、序列拼接以及去除嵌合體，之后以97%的相似度進行OTU聚類，再將OTU信息與Greengenes rDNA數(shù)據(jù)庫進行比對，注釋各OTU的分類單元，得到OTU分布表格。

（2）利用QIIME中自帶的數(shù)據(jù)處理語句或者R軟件中vegan軟件包的程序?qū)TU分布信息進行分析，并比較不同樣品間多樣性及微生物分布的差異。QIIME 的具體使用方法見網(wǎng)址：http：／／qiime.org／tutorials／tutorial.html。

3 結(jié)果與討論

3.1 升溫對于下層土土壤微生物分類以及功能上分布的影響

根據(jù)下層土土壤微生物的16S rRNA序列測序結(jié)果表明，下層土中相對豐度較高的門有酸桿菌門（Acidobacteria），放線菌門（Actinobacteria），綠彎菌門（Chloroflexi），芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），浮霉菌門（Planctomycetes），變形菌門（Proteobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia），升溫沒有顯著影響微生物的群落分布（圖2（a）），在較低的尺度的門、綱等尺度上，升溫也沒有對微生物群落分布造成顯著的影響（圖2（b））。測序結(jié)果的DCA分析結(jié)果表明升溫處理的樣品點并沒有與對照處理分開（圖2（d））。這些結(jié)果都說明升溫并不會影響土壤微生物群落的整體組成。

本文使用GeoChip比較升溫處理和對照之間微生物功能基因豐度的差異。共檢測了49 857個基因，其中85%屬于細菌，10%屬于真菌。與16S測序結(jié)果不同，DCA分析結(jié)果顯示，對于功能基因的分布，升溫處理樣品點和對照樣品點都是分開聚集，這說明升溫處理極大地改變了土壤微生物功能性基因的分布。升溫處理顯著改變了16%總的功能性基因的相對豐度，并改變了15.6%的細菌功能性基因的分布以及21%的真菌功能性基因的分布；同時升溫處理顯著提升了20.4%的碳循環(huán)相關(guān)功能基因的豐度。實驗結(jié)果表明，升溫處理雖然沒有顯著改變微生物群體分類方面的結(jié)構(gòu)，卻改變了微生物群體的功能結(jié)構(gòu)。這與之前類似的研究結(jié)果是一致的，環(huán)境變量會大幅度地改變微生物的功能結(jié)構(gòu)，卻沒有明顯改變微生物的分類結(jié)構(gòu)［17］。

圖2 升溫對于下層土土壤微生物分類以及功能上分布的影響。（a）相對豐度較高的門；（b）溫度對于微生物不同分類水平分布效應(yīng)的P值；（c）溫度對所有基因以及細菌、真菌和碳循環(huán)功能基因效應(yīng)的P值。（b）圖和（c）圖中虛線以下代表升溫效應(yīng)在統(tǒng)計上顯著（P＜0.05）；（d）～（g）微生物群體的DCA 排序分析，包括：基于16S rRNA測序結(jié)果的細菌分類（d），基于GeoChip的微生物功能基因（e）、細菌基因（f）和真菌基因（g）。實心圈代表升溫處理，空心圈代表對照

3.2 升溫和對照處理下微生物群落在分類和功能上的結(jié)構(gòu)

SIP實驗分離出的13C-DNA和12C-DNA的16S序列擴增和測序結(jié)果表明，利用13C的微生物群體和不利用13C的微生物群體有很大的差異（圖3（a），（b））。SIP實驗分離出的DNA的GeoChip測定結(jié)果表明，無論是對于13C-DNA還是12C-DNA，升溫處理下的功能基因分布都與對照處理下差異很大，而可利用13C的微生物功能基因又與利用12C的微生物功能基因分布差異很大（圖3（c）～（e））。結(jié)果說明，升溫對于碳分解相關(guān)功能基因分布的影響十分顯著。

圖3 SIP實驗中升溫和對照處理下微生物群落在分類和功能上的結(jié)構(gòu)。（a）占優(yōu)勢的門的相對豐度；（b）～（e）總的微生物群體以及可利用13C的微生物群體在分類和功能上的結(jié)構(gòu)分布。其中：（b）基于16S測序的細菌群體；（c）GeoChip測的全部功能基因；（d）細菌的功能性基因；（e）真菌的功能性基因。圖中實心符號代表升溫處理，空心符號代表對照處理

4 結(jié)語

本實驗將16S rRNA高通量測序技術(shù)與同位素探針技術(shù)應(yīng)用于生態(tài)學(xué)本科實驗教學(xué)中。通過本實驗，一方面學(xué)生切身體驗到如何用試劑盒進行土壤DNA的提取，瓊脂糖電泳擴增與檢測，Illumina MiSeq測序以及測序結(jié)果的分析等一系列過程，大大激發(fā)了學(xué)生探索土壤微生物多樣性奧秘的興趣；另一方面，學(xué)生學(xué)習(xí)了如何利用統(tǒng)計分析軟件對OTU分布信息進行分析，并比較不同樣品間多樣性及微生物分布的差異，開拓了學(xué)生在生態(tài)學(xué)統(tǒng)計及應(yīng)用方面的思路。實踐證明，該實驗提高了學(xué)生綜合性實驗?zāi)芰?，包括實驗操作、?shù)據(jù)分析處理、結(jié)果探索以及多種實驗手段的融合，為學(xué)生的進一步科學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。