韓蕾蕾，王紅霞，李陽，張樂樂，袁祖麗

(河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州 450002)

植物體自身具有響應(yīng)Cd脅迫的機制，可通過信號調(diào)控、酶促和非酶促反應(yīng)等清除過量ROS，在一定程度上緩解Cd脅迫產(chǎn)生的過量ROS造成的氧化傷害[14]。類黃酮、NO、H2O2既屬于植物生長發(fā)育過程中的信號物質(zhì)，也參與植物逆境生理過程。類黃酮(Flavonoid)是一類廣泛存在于植物中的多酚類次生代謝產(chǎn)物，是活性氧自由基的清除劑，可以直接清除H2O2,·OH,1O2等活性氧分子[15-17]。王宇濤等[18]研究表明，Cd脅迫下擬南芥植株類黃酮含量增加，通過積累的類黃酮發(fā)揮其抗氧化作用而提高其對Cd的耐受性。岳凱等[19]研究表明,在干旱脅迫下藜麥葉片類黃酮含量升高，不同程度干旱脅迫下的類黃酮對自由基的清除能力不同，在5%的聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)干旱處理下表現(xiàn)出最強的自由基清除力。

NO是一種可擴散的氣態(tài)信號分子，在植物的生長、發(fā)育和抗逆脅迫中起著至關(guān)重要的作用[20]。NR被公認為內(nèi)源性NO生物合成的重要酶源，催化亞硝酸鹽還原生成NO；脅迫下，植物光合作用被破壞，電子傳遞受阻，碳代謝與氮代謝的失衡，NR會利用胞漿中累積的亞硝酸鹽大量合成NO[21]。NO具有清除Cd脅迫產(chǎn)生的過量H2O2能力[8]。CKAYA等[22]研究顯示，NO通過加速抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(ASA-GSH)增強辣椒對Cd的耐受性。

叢枝真菌是生態(tài)系統(tǒng)中一類分布廣泛的內(nèi)生菌根菌，可與大多數(shù)高等植物根系共生，產(chǎn)生叢枝菌根，直接或間接地參與緩解Cd污染對植物造成的氧化損傷[23]。研究表明，接種叢枝真菌可以提高共生植物的抗氧化酶活性，清除過積累的ROS；可以提高葉綠素含量，增強葉片光合作用，促進植物的生長與發(fā)育[24-25]。叢枝真菌在形成菌根共生體的過程中可以影響植物多種信號物質(zhì)的合成，如類黃酮、NO、H2O2等，通過類黃酮、NO、H2O2的作用緩解逆境傷害[26]。因此，本試驗通過對Cd污染土壤小麥接種叢枝真菌后類黃酮含量、NO含量、NR活性和H2O2含量的研究，探討叢枝真菌對Cd脅迫小麥幼苗的修復(fù)機制，為Cd污染土壤小麥栽培的原位修復(fù)技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設(shè)計

小麥(TriticumaestivumL.)品種為百農(nóng)207。叢枝真菌(Arbuscularmycorrhizalfungi,AMF)為摩西球囊霉菌(Glomusmosseae,Gm)。

采用土培的試驗方法，營養(yǎng)土滅菌后晾干備用。塑料杯消毒，未接種叢枝真菌的杯子裝入120 g已滅菌營養(yǎng)土，接種叢枝真菌的杯子裝入115 g營養(yǎng)土和5 g菌種。小麥種子用3%的H2O2浸泡消毒20 min，再用蒸餾水沖洗數(shù)次，浸泡30 min。每杯播種36粒種子，將杯子放置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置為14 h光照/10 h黑暗，溫度為16～25 ℃，相對濕度為80%，光照度為0～100 μmol·m2·s-1。

種子播種3 d后，對小麥幼苗進行Cd脅迫處理。此后幼苗每2 d澆灌Hoagland’s營養(yǎng)液50 mL。每個處理重復(fù)5次。幼苗生長至兩葉一心后，將葉片用錫箔紙包裹迅速放液氮冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗設(shè)計為6個處理，分別為：對照(CK)；對照接種叢枝真菌(CK+AMF)；5 mg·kg-1Cd脅迫(Cd5)；5 mg·kg-1Cd脅迫接種叢枝真菌(Cd5+AMF)；10 mg·kg-1Cd脅迫(Cd10)；10 mg·kg-1Cd脅迫接種叢枝真菌(Cd10+AMF)。

1.2 研究內(nèi)容與方法

研究檢測了小麥幼苗葉片類黃酮含量、NR活性、NO含量、H2O2含量，分別進行3個重復(fù)。

1.2.1 類黃酮含量 小麥幼苗葉片類黃酮含量測定參考董李平等[27]的方法，對小麥幼苗葉片類黃酮含量進行檢測。準確稱取小麥幼苗葉片干粉0.2 g，40%乙醇(pH值為3)室溫提取24 h，用提取溶劑定容至50 mL。取提取液0.5 mL于試管中，依次加入2 mL雙蒸水和5%亞硝酸鈉0.15 mL，靜置5 min；加10%六水氯化鋁0.15 mL，混勻靜置5 min；再加入3 mol·L-1的氫氧化鈉溶液1 mL，靜置15 min，使用紫外可見分光光度計在波長415 nm處檢測吸光值。以蘆丁為標準品繪制標準曲線。

1.2.2 NR活性 NR活性檢測采用索萊寶公司的硝酸還原酶酶活性檢測試劑盒，根據(jù)說明書操作。將新鮮小麥幼苗葉片洗凈，放入誘導(dǎo)劑應(yīng)用液中避光浸泡，2 h后取出，濾紙吸干，-20 ℃冷凍30 min。稱取約0.1 g樣本，加入1 mL提取液，冰浴下研磨，在4 ℃下以4 000×g離心10 min，收集上清液待用。按照說明書設(shè)定測定管和空白管，分別依次加入試劑，使用酶標儀測定波長340 nm下的初始吸光值A(chǔ)1，25 ℃反應(yīng)30 min后再次測定吸光值A(chǔ)2，進而計算酶活性。

1.2.3 NO含量 NO含量測定參考OKANT等[28]的方法。稱取0.5 g試驗小麥幼苗葉片，加液氮研磨，然后加入3 mL濃度為50 mol·L-1的冷乙酸緩沖液(pH值為3.6，含有4%二乙酸鋅)，在4 ℃下以10 000×g離心15 min，取上清液。在剩余沉淀中加入1 mL緩沖液，在4 ℃下以10 000×g離心15 min，取其上清液。將2次所取上清液混合，加入0.1 g木炭，渦旋混勻后，在4 ℃下以12 000×g離心10 min，收取最終上清液，待用。取最終上清液1 mL，和1 mL Gress試劑充分混勻，室溫30 min后，使用紫外可見分光光度計在波長540 nm處檢測樣本的吸光值。通過與NaNO2的標準曲線比較計算NO的含量。

1.2.4 H2O2濃度 H2O2含量測定參考王浩[29]的方法。取新鮮小麥幼苗葉片0.2 g，加液氮研磨，然后加入4 mL 0.1%的三氯乙酸，研磨成勻漿。在4 ℃下以12 000×g離心10 min，收集上清液。準備新的離心管，依次向管中加入1 mL上清液，0.5 mL 10 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7)，1 mol·L-1的KI溶液1 mL?；靹蚝?，使用紫外可見分光光度計在波長390 nm處檢測吸光值。通過與H2O2標準曲線比較計算H2O2的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2013進行基本的數(shù)據(jù)處理，用DPS v 14.10對數(shù)據(jù)進行LSD-二因素有重復(fù)試驗統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢枝真菌對Cd脅迫小麥幼苗葉片類黃酮含量的影響

如圖1所示，對照接種叢枝真菌小麥幼苗葉片類黃酮含量比對照小麥幼苗顯著上升12.53%；5和10 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗與對照小麥幼苗比較，5和10 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗葉片類黃酮含量有所提高；分別對5和10 mg·kg-1Cd脅迫小麥接種叢枝真菌，Cd脅迫接種叢枝真菌小麥幼苗葉片類黃酮含量與同質(zhì)量濃度Cd脅迫小麥幼苗相比，類黃酮含量變化不顯著。結(jié)果表明，接種叢枝真菌可以提高Cd脅迫小麥幼苗葉片類黃酮含量。

CK：對照；CK+AMF：對照接種叢枝真菌；Cd5：5 mg·kg-1 Cd脅迫；Cd5+AMF：5 mg·kg-1 Cd脅迫接種叢枝真菌；Cd10：10 mg·kg-1 Cd脅迫；Cd10+AMF：10 mg·kg-1 Cd脅迫接種叢枝真菌。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。CK:Control;CK+AMF:Control inoculation;Cd5:5 mg·kg-1 Cd stress;Cd5+AMF:5 mg·kg-1 Cd stress inoculation;Cd10:10 mg·kg-1 Cd stress;Cd10+AMF:10 mg·kg-1 Cd stress inoculation.The different lowercase letters show the significant differences(P<0.05).The same as below.圖1 叢枝真菌對Cd脅迫小麥幼苗葉片類黃酮含量的影響Fig.1 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on flavonoid content of wheat seedling leaves under Cd stress

2.2 叢枝真菌對Cd脅迫小麥幼苗葉片NR活性的影響

如圖2所示，對照接種叢枝真菌小麥幼苗葉片NR活性是對照小麥幼苗葉片的2.14倍，差異顯著；5和10 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗葉片的NR活性與對照小麥幼苗相比，均有所提高，其中10 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗葉片的NR活性呈5%顯著水平，提高了68.50%；5和10 mg·kg-1Cd脅迫接種叢枝真菌小麥幼苗葉片NR活性分別是同質(zhì)量濃度Cd脅迫小麥幼苗的1.94,2.03倍，差異顯著。結(jié)果表明，接種叢枝真菌可以提高Cd脅迫小麥幼苗葉片NR活性。

圖2 叢枝真菌對Cd脅迫小麥幼苗葉片NR活性的影響Fig.2 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on nitrate reductase activity in wheat seedling leaves under Cd stress

2.3 叢枝真菌對Cd脅迫小麥幼苗葉片NO含量的影響

如圖3所示，對照接種叢枝真菌小麥幼苗NO含量與對照小麥幼苗相比有所提高，差異不顯著；5和10 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗與對照小麥幼苗比較，葉片NO含量均有所提高；而5和10 mg·kg-1Cd脅迫接種叢枝真菌小麥幼苗NO含量分別比同質(zhì)量濃度Cd脅迫小麥幼苗上升50.70%,35.96%，差異顯著。結(jié)果表明，接種叢枝真菌可以提高Cd脅迫小麥幼苗葉片NO含量。

圖3 叢枝真菌對Cd脅迫小麥幼苗葉片NO含量的影響Fig.3 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on nitric oxide content in wheat seedling leaves under Cd stress

2.4 叢枝真菌對Cd脅迫小麥幼苗葉片H2O2濃度的影響

如圖4所示，對照接種叢枝真菌小麥幼苗H2O2濃度比對照小麥幼苗顯著下降31.57%；5和10 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗H2O2濃度比對照小麥幼苗分別顯著上升9.34%，14.19%；5和10 mg·kg-1Cd脅迫接種叢枝真菌小麥幼苗H2O2濃度顯著比同質(zhì)量濃度Cd脅迫小麥幼苗分別下降34.77%,36.07%。結(jié)果表明，接種叢枝真菌會降低Cd脅迫小麥幼苗葉片H2O2濃度，緩解Cd脅迫對小麥幼苗造成的氧化傷害。

圖4 叢枝真菌對Cd脅迫小麥幼苗葉片H2O2濃度的影響Fig.4 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on hydrogen peroxide content in wheat seedling leaves under Cd stress

3 結(jié)論與討論

逆境脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量活性氧自由基，ROS是否會起到破壞性或信號分子的作用,取決于ROS產(chǎn)生和清除之間的微妙平衡。植物已經(jīng)進化出一個復(fù)雜的基于ROS合成、清除和信號物質(zhì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，來介導(dǎo)生物和非生物脅迫反應(yīng)。類黃酮在保護植物非生物和生物脅迫因素的負面影響方面發(fā)揮著主要作用[30]。作為抗氧化物質(zhì)的類黃酮可直接消除活性氧而保護細胞免受氧化傷害[31]。研究顯示，接種叢枝真菌可以提高植物果實中類黃酮(如花青素)水平[32]。本研究結(jié)果表明，5和10 mg·kg-1Cd脅迫對小麥幼苗葉片類黃酮的作用不顯著；Cd脅迫小麥幼苗接種叢枝真菌較同質(zhì)量濃度Cd脅迫小麥幼苗，其類黃酮含量有所提高。這與TORRES等[32]研究結(jié)果一致。在5和10 mg·kg-1Cd脅迫下，Cd脅迫小麥幼苗和同質(zhì)量濃度Cd脅迫接種叢枝真菌小麥幼苗葉片相比，10 mg·kg-1Cd脅迫導(dǎo)致小麥幼苗類黃酮含量上升趨勢較5 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗低，可能因為10 mg·kg-1Cd脅迫對植物的傷害增大，接種叢枝真菌雖能提高植株類黃酮含量，但用于清除活性氧的類黃酮消耗增大，所以隨著Cd脅迫質(zhì)量濃度的增加，類黃酮含量上升趨勢下降。

本研究結(jié)果表明，5和10 mg·kg-1Cd脅迫均顯著增加小麥幼苗葉片NR活性，且10 mg·kg-1Cd處理高于5 mg·kg-1Cd處理的NR活性；不同質(zhì)量濃度Cd脅迫接種叢枝真菌均可以顯著提高小麥幼苗葉片NR活性。這與CARAVACA等[33]研究結(jié)果一致。由于NR是NO合成的重要酶，其活性提高有助于提高NO含量，后者具有抗氧化功能，可緩解植物的氧化傷害[34]。研究表明，外源NO可降低草莓的MDA(Malondialdehyde)含量和H2O2含量，緩解脅迫造成的氧化傷害[35]，而Cd脅迫使植物內(nèi)源NO含量上升[33]。Cu脅迫也可促進大麥幼苗NO的釋放，且NO釋放量最高時NR活性最高[36]。本研究結(jié)果表明，5和10 mg·kg-1Cd脅迫下，小麥幼苗葉片NR活性和NO含量均有所提高，不同質(zhì)量濃度Cd脅迫接種叢枝真菌小麥幼苗葉片NR活性和NO含量顯著高于同質(zhì)量濃度Cd脅迫未接種處理。說明接種叢枝真菌可以提高Cd脅迫小麥幼苗的NO濃度，并且通過與H2O2發(fā)生反應(yīng)降低H2O2濃度，從而發(fā)揮抗氧化功能，緩解Cd脅迫對小麥幼苗的氧化傷害[37-38]。

Cd脅迫造成小麥幼苗葉片H2O2濃度顯著升高，且10 mg·kg-1Cd脅迫H2O2濃度高于5 mg·kg-1Cd脅迫，而2種質(zhì)量濃度Cd脅迫小麥幼苗分別接種叢枝真菌后H2O2濃度均顯著下降。說明接種叢枝真菌可以降低Cd脅迫造成的氧化傷害。本研究表明，叢枝真菌可以通過提高類黃酮和NO含量，降低Cd脅迫產(chǎn)生的過量ROS，緩解Cd脅迫造成的氧化傷害。