晁利芹 王 付

河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院 (河南 鄭州， 450046)

肝纖維化是肝損傷發(fā)展至肝硬化的中間環(huán)節(jié)，及時(shí)阻斷或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生至關(guān)重要，但西藥抗纖維化毒副作用較大，尋找毒副作用小的中醫(yī)藥治療方法成為了當(dāng)今熱點(diǎn)。肝纖維化屬于中醫(yī)的“郁證”、“脅痛”、“痞滿”、“腹痛”、“積聚”、“癥瘕”、“鼓脹”等范疇，病機(jī)符合肝氣郁滯、脾胃虛弱、絡(luò)脈瘀阻[1]，治以加味四逆散，疏肝健脾、益氣養(yǎng)血，可阻斷或逆轉(zhuǎn)肝纖維化，且毒副作用小。本研究探討了加味四逆散對(duì)豬血清誘導(dǎo)的大鼠免疫損傷性肝纖維化的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 加味四逆散由柴胡、枳實(shí)、白芍、人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、昆布各10 g所組成，實(shí)驗(yàn)所用中藥材購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，水煎并濃縮為含生藥3.75 g/ml的藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｇ锼蓧A片(西雙版納制藥廠)研碎，用0.2%羧甲基纖維素鈉配制0.75‰混懸液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料 SPF級(jí)雌性 Wistar大鼠100只，體重(120±10)g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)〔SCXK(豫)2017-0001〕；動(dòng)物顆粒飼料，購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)〔SCXK(豫)2015-0005〕。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 本研究獲得河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可，大鼠按照河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用規(guī)則飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室相對(duì)封閉，自然采光良好，實(shí)驗(yàn)室相對(duì)溫度控制在 20～25℃之間，相對(duì)濕度控制在60%左右，12 h明暗交替，自由攝食進(jìn)水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，100只大鼠按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、秋水仙堿組、加味四逆散組、預(yù)防組，每組20只。

1.3.2 肝纖維化模型制備 參考文獻(xiàn)報(bào)道方法用豬血清誘導(dǎo)免疫損傷性肝纖維化模型[2-4]。除正常組外，其余各組均腹腔注射未滅活的豬血清，0.5 ml/次/只，每周兩次；第5周之后，每2～3只大鼠關(guān)在一籠內(nèi)，用尖端包紗布的止血鉗鉗夾其中一鼠鼠尾，使其保持激怒狀態(tài)并與同籠鼠爭(zhēng)斗撕咬，以不破皮流血為度，每次刺激5 min，2次/d，同時(shí)每周皮下注射0.1%腎上腺素0.2 ml；隔2日喂食，喂食日食量不限，8周后即可形成氣郁脾虛瘀阻證肝纖維化。

動(dòng)物模型成功判定：空白組和參與造模組之間，血清肝功能、肝纖維化指標(biāo)差異顯著，肝纖維化大鼠肝臟組織病變明顯，膠原沉積。

1.3.3 給藥方法 預(yù)防組大鼠于造模同時(shí)給藥，每天按7 mg/kg劑量給予疏肝健脾通絡(luò)法方藥灌胃，連續(xù)給藥16周；造模后第9周，模型組和空白組大鼠分別給予與預(yù)防組等量的生理鹽水灌胃，加味四逆散組大鼠每天按7 mg/kg劑量給予加味四逆散藥液灌胃，秋水仙堿組大鼠每天按0.2 mg/kg劑量給予0.75‰秋水仙堿混懸液，至第16周末結(jié)束。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)樣品收集 末次灌胃后，大鼠禁食不禁水2 h，腹主動(dòng)脈取血后4℃ 3 000 r/min離心15 min，收集血清，于-80℃保存?zhèn)溆?。采血完畢后，剖腹迅速取出完整肝葉，用冷鹽水漂洗除去表面血液，濾紙拭干稱重，計(jì)算肝臟系數(shù)，肝臟系數(shù)可以大體判斷臟器病變的程度和性質(zhì)，肝臟系數(shù)(%)=肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100。除凈周圍的結(jié)締組織，取肝右葉置于-80℃低溫冰箱保存、備檢。取肝左葉立即置于10%甲醛溶液固定48 h，脫水、包埋、切片，MASSON染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

1.3.5 觀察指標(biāo) ①一般中醫(yī)癥候指標(biāo)，包括體重、外觀行為(毛發(fā)色澤、行為、飲食、精神狀態(tài)等)；②肝功能指標(biāo)，包括血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、球蛋白(Glo)、白蛋白(Alb)、白球比(A/G)、總蛋白(TP)；③肝纖維化指標(biāo)，包括Ⅲ型前膠原氨基末端肽(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、層粘連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)；④大鼠肝組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA 表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 加味四逆散對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，空白組大鼠精神狀態(tài)良好，行動(dòng)靈巧，皮毛有光澤，食欲佳，大便正常。模型組大鼠精神萎靡不振，行動(dòng)遲緩，懶動(dòng)，皮毛無光澤，納差，腹脹，腹瀉。加味四逆散組大鼠皮毛光滑，活動(dòng)力強(qiáng)，飲食尚可，大便可，體重有所增加。

2.2 加味四逆散對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟系數(shù)的影響 見表1。

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟系數(shù)的比較

2.3 加味四逆散對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝功能的影響 加味四逆散能有效改善實(shí)驗(yàn)大鼠肝功能，降低肝損傷程度，但在實(shí)驗(yàn)階段大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT含量還不能恢復(fù)至正常范圍，見表2。加味四逆散可提高實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟合成蛋白質(zhì)的能力，改善肝臟損傷程度，見表3。

2.4 加味四逆散對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝纖維化指標(biāo)的影響 加味四逆散可以降低大鼠肝纖維化水平，對(duì)大鼠肝纖維化具有改善作用，見表4。

2.5 加味四逆散對(duì)大鼠肝組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA表達(dá)的影響 加味四逆散組可以降低大鼠肝組織中TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)水平，保持Smad7 mRNA表達(dá)水平，見表5。

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝功能的比較

表3 各組大鼠血清蛋白含量及A/G的比較

表4 各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)的比較

表5 各組大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA水平的比較

2.6 加味四逆散對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織病理學(xué)變化的影響 肝臟外觀觀察結(jié)果：空白組大鼠肝臟表面光滑，質(zhì)地柔軟，邊緣鋒利；模型組大鼠肝臟表面粗糙，質(zhì)地偏硬，體積偏大，邊緣變鈍；秋水仙堿組、加味四逆散組、預(yù)防組大鼠均肝臟表面尚光滑，質(zhì)地尚柔軟，邊緣鋒存在。鏡下觀察MASSON染色，空白組大鼠僅見匯管區(qū)有少量的纖維組織。模型組大鼠肝臟見大量纖維組織增生，假小葉形成。秋水仙堿組、加味四逆散組、預(yù)防組大鼠均可見有較少纖維組織增生，提示其具有良好的改善療效，見圖1。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟組織病理改變圖(MASSON染色，400×)

3 討論

肝硬化或肝癌是嚴(yán)重危害人民健康的重大疾病，具有較高的致病率、致死率，嚴(yán)重危害人類健康，給患者身心帶來極大痛苦，增加家庭及社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。肝纖維化是慢性肝病與肝硬化、肝癌的中間環(huán)節(jié)，及時(shí)阻斷或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展成了防治肝硬化、肝癌的關(guān)鍵一步。大量研究證實(shí)，中藥復(fù)方在防治肝纖維化的方面具有一定優(yōu)勢(shì)。本研究主要探討基于疏肝健脾通絡(luò)法下的加味四逆散抗肝纖維化的作用機(jī)制。

采用腹腔注射豬血清制備免疫損傷性肝纖維化模型，能反映肝纖維化的發(fā)病機(jī)制與病理變化。豬血清中白蛋白是外來異體抗原，多次注射可引起變態(tài)反應(yīng)，加劇血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，促進(jìn)血小板聚集和紅細(xì)胞聚集，肝纖維化成模后，聯(lián)合止血鉗鉗夾鼠尾激怒法及暴飲暴食的隔日喂食的脾虛方法，從而使造模動(dòng)物產(chǎn)生肝郁脾虛絡(luò)瘀證的病理狀態(tài)，并與肝郁脾虛絡(luò)瘀證的中醫(yī)病機(jī)相符合。本研究采用腹腔注射未滅活豬血清聯(lián)合保持激怒饑餓狀態(tài)的方法，使實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟系數(shù)、血清肝功能、血清肝纖維化指標(biāo)顯著升高，Alb、TP、A/G顯著下降，肝組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)水平均顯著升高，Smad7 mRNA表達(dá)水平顯著下降，在灌胃加味四逆散56 d后，上述指標(biāo)均有不同程度地改善，且在實(shí)驗(yàn)時(shí)間范圍及實(shí)驗(yàn)劑量與藥物秋水仙堿具有相近的療效。

ALT、AST、ALP、GGT是反映肝臟功能的重要指標(biāo)，當(dāng)肝細(xì)胞損傷或壞死時(shí)，血液中ALT、AST、ALP、GGT的含量就會(huì)升高。肝臟是蛋白質(zhì)合成的重要場(chǎng)所。當(dāng)肝細(xì)胞受到損害，蛋白質(zhì)的合成、運(yùn)輸、釋放將會(huì)受到影響，含量會(huì)下降。加味四逆散能夠降低實(shí)驗(yàn)大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT，減輕肝損傷、促進(jìn)肝臟蛋白質(zhì)合成，改善肝功能。HA、PCⅢ、CⅣ、LN是反映肝纖維化的重要指標(biāo)。HA水平含量能靈敏的反映肝纖維量；PCⅢ反映肝纖維合成和炎癥活動(dòng)性狀況；CⅣ是最初形成的纖維，可敏感地反映肝炎向肝纖維化轉(zhuǎn)變發(fā)展的程度和過程，是肝纖維化早期診斷的重大指標(biāo)；LN反映肝臟的受損程度，可判別是否存在活動(dòng)性肝纖維化的指標(biāo)。加味四逆散能夠降低實(shí)驗(yàn)大鼠血清HA、PCⅢ、CⅣ、LN含量，改善實(shí)驗(yàn)大鼠肝纖維化。研究表明TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是肝纖維化最關(guān)鍵的細(xì)胞信號(hào)通道。TGF-β1與肝星狀細(xì)胞膜受體結(jié)合，活化該受體，繼而磷酸化Smad蛋白，其中，p-Smad2、p-Smad3誘導(dǎo)形成TGF-β/Smad復(fù)合物，活化肝星狀細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)。然而，Smad7屬于抑制Smad蛋白，p-Smad7的表達(dá)上調(diào)，可以抑制Smad2、Smad3的磷酸化而阻斷肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)型，減弱肝星狀細(xì)胞內(nèi)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻斷膠原蛋白合成。

研究結(jié)果說明加味四逆散具有抗肝臟纖維化的治療作用，方中柴胡疏肝解郁；枳實(shí)降氣導(dǎo)滯，與柴胡配伍，柴胡偏于升，枳實(shí)偏于降，一升一降，調(diào)理肝脾，疏達(dá)氣機(jī)；芍藥益血斂肝，與柴胡配伍，柴胡偏于散，芍藥偏于斂，一散一斂，調(diào)理氣機(jī)；人參補(bǔ)益中氣；白術(shù)健脾益氣，與人參配伍，人參偏于生津，白術(shù)偏于燥濕；茯苓益氣利濕；昆布咸、寒，入肝、腎經(jīng)，軟堅(jiān)散結(jié)，價(jià)廉且可長(zhǎng)期服用；甘草益氣緩急，既能防柴胡疏散太過，又能防枳實(shí)降泄太過，更能助芍藥收斂緩急，還能助人參、白術(shù)、茯苓健脾益氣。方藥相互為用，以奏疏肝健脾，益氣養(yǎng)血，軟堅(jiān)散結(jié)，以此治療可以改善肝功能及肝纖維指標(biāo)，毒副作用小，值得進(jìn)一步研究。