鄭少華 夏菁菁 賈真麗 侯麗麗 程 雪 李恒力 趙 彩

1.河北省衡水市人民醫(yī)院肝膽胰外科 (河北 衡水， 053000) 2.衡水市人民醫(yī)院消化內(nèi)科

肝細(xì)胞癌(HCC)仍然是癌癥相關(guān)死亡的第三大常見原因，中國是肝癌發(fā)病最嚴(yán)重的國家之一，大約80%的肝癌病例與乙型肝炎病毒(HBV)感染和黃曲霉毒素接觸有關(guān)[1]。除晚期肝癌外，肝移植和手術(shù)切除是治療肝癌的最佳選擇[2]。然而，肝癌根治性切除術(shù)后長期預(yù)后仍然令人失望，因?yàn)槟[瘤復(fù)發(fā)率高，據(jù)報(bào)道5年后有70%的病例復(fù)發(fā)。監(jiān)測計(jì)劃、個(gè)體化治療和隨訪可能會改善肝癌患者的預(yù)后[3]。miR-21是一種關(guān)鍵的癌基因microRNA(miR)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)蛋白8樣-1(TNFAIP8L1或TIPE1)是TIPE家族的新成員，本文探討了HCC患者肝癌組織及外周血中miR-21和TIPE1的表達(dá)水平以及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院收治的229例HCC患者，所有患者均經(jīng)病理檢查確證，術(shù)前均未接受化療或放療，術(shù)中采集肝癌及癌旁組織標(biāo)本，癌旁組織定義為距腫瘤邊緣至少1 cm的組織?；颊咭话闱闆r及臨床病理特征見表1。本研究經(jīng)我院倫理委員會審批同意，所有受試者均簽署書面知情同意。

表1 患者一般情況及臨床病理特征 (n=229)

1.2 研究方法

1.2.1 生存率研究 肝切除術(shù)后每3個(gè)月隨訪1次。常規(guī)檢查包括腫瘤標(biāo)志物、肝功能和腹部B超，每6個(gè)月或血清AFP持續(xù)升高時(shí)進(jìn)行腹部CT和/或MRI檢查，根據(jù)2項(xiàng)或2項(xiàng)以上的影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)新病灶即診斷為復(fù)發(fā)?？偵媛?OS)的研究終點(diǎn)為手術(shù)切除后至死亡或最近的隨訪時(shí)間，無復(fù)發(fā)生存率(RFS)的研究終點(diǎn)為手術(shù)切除后至首次診斷復(fù)發(fā)的時(shí)間。

1.2.2 miR-21表達(dá)水平檢測 采用ABI-PRISM 7900HT RT-PCR系統(tǒng)，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測患者肝癌組織及外周血中miR-21表達(dá)水平。利用TRIzol試劑(Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)檢測miR-21轉(zhuǎn)錄水平。程序設(shè)置如下： 95℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；95℃、65℃、30℃各1 min。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。

1.2.3 Western Blot分析 收集肝癌組織，在冰冷裂解緩沖液中裂解。BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜(美國Millipore公司)上孵育anti-TIPE1和anti-GAPDH抗體，再與HRP結(jié)合的抗兔IgG抗體(1∶5 000稀釋，CST公司)孵育1 h，然后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(美國Santa Cruz公司)和顯影，采集圖像并分析目的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 7.0軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者外周血及肝癌組織miR-21表達(dá)情況 與正常人群或癌旁組織比較，HCC患者外周血和肝癌組織miR-21表達(dá)量顯著提高(圖1A，1C)；Ⅲ～Ⅳ期HCC患者外周血和肝癌組織miR-21表達(dá)顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者(圖1B、1D)。

2.2 miR-21對HCC患者OS和RFS的影響 miR-21低表達(dá)組HCC患者的OS和RFS優(yōu)于miR-21高表達(dá)組，見圖2。

2.3 HCC患者外周血及肝癌組織TIPE1表達(dá)情況 與正常人群或癌旁組織比較，HCC患者外周血和肝癌組織TIPE1 mRNA表達(dá)量顯著提高(圖3A、3C)；Ⅲ～Ⅳ期HCC患者外周血和肝癌組織TIPE1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者(圖3B、3D、3E、3F)。

2.4 TIPE1對HCC患者OS和RFS的影響 TIPE1低表達(dá)組HCC患者的OS和RFS優(yōu)于TIPE1高表達(dá)組，見圖4。

圖1 HCC患者外周血及肝癌組織miR-21表達(dá)情況 A、B為HCC患者外周血，C、D為HCC患者肝癌組織

圖2 miR-21對HCC患者OS和RFS的影響

圖3 HCC患者外周血及肝癌組織TIPE1表達(dá)情況 (A、B為肝癌患者血清mRNA表達(dá)量，C、D為肝癌組織mRNA表達(dá)量，E、F為肝癌組織蛋白表達(dá)量)

圖4 TIPE1對HCC患者OS和RFS的影響

3 討論

MicroRNAs(miRs)是一類參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和發(fā)育等生物學(xué)過程的小分子非編碼RNA，由于癌基因miRs(oncomiRs)的基因擴(kuò)增、異常表達(dá)和功能突變增加，以及腫瘤抑制miRs(suppressor miRs)的缺失或失活，miRs在人類癌癥中的調(diào)節(jié)失調(diào)?；趍iR的治療策略有望用于癌癥治療[4]。然而，單靶向miR不足以在體內(nèi)獲得顯著的治療效果。miR-21是一種關(guān)鍵的癌基因，在多種癌癥類型中高度表達(dá)，研究表明miR-21過度表達(dá)通過抑制一系列腫瘤抑制基因的表達(dá)促進(jìn)增殖、侵襲和遷移[5]，有研究發(fā)現(xiàn)GAS5可以通過抑制肝癌細(xì)胞miR21的表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[6]。研究表明，miR-21與結(jié)直腸癌、食管癌和肝細(xì)胞癌的預(yù)后有關(guān)[7]，miR-21通過TGF-β變異或PPP2R2A/ERK參與膀胱癌的發(fā)展和進(jìn)展[8]。miR-21的下調(diào)通過靶向PI3K/AKT和JAK/STAT3信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并可能與其他miR和微調(diào)蛋白輸出協(xié)同或協(xié)同作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，在HCC患者外周血和肝癌組織中miR-21表達(dá)量顯著提高，Ⅲ～Ⅳ期HCC患者外周血和肝癌組織的miR-21表達(dá)顯著高于Ⅰ～Ⅱ期HCC患者，miR-21低表達(dá)組患者的OS和RFS優(yōu)于miR-21高表達(dá)組，說明miR-21在肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后中具有及其重要的作用。

TIPE1是TIPE家族的新成員，TIPE家族的成員被認(rèn)為是免疫穩(wěn)態(tài)、炎癥和腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)者，盡管它們具有顯著的結(jié)構(gòu)域同源性，但它們的生物學(xué)功能是多項(xiàng)的[10]。與TIPE2不同，TIPE1除了在成熟的B和T淋巴細(xì)胞和大多數(shù)人類癌細(xì)胞系中表達(dá)外，在各種小鼠組織中都有表達(dá)[11]。TIPE1在某些炎癥性疾病中起負(fù)調(diào)節(jié)作用，可通過下調(diào)MDR1的轉(zhuǎn)錄使骨肉瘤細(xì)胞對順鉑敏感減弱[11]。有研究報(bào)道TIPE1可通過負(fù)調(diào)控Rac1的激活而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制骨肉瘤、肺癌和胃癌中的腫瘤生長、侵襲和遷移[12]。TIPE1在體內(nèi)和體外都能顯著降低乳腺癌細(xì)胞的生長。在致癌方面的作用，TIPE1通過抑制Rac1及其靶點(diǎn)p65和c-Jun的 N-末端激酶途徑顯著減少，誘導(dǎo)HCC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)caspase非依賴性凋亡；也有報(bào)道TIPE1通過抑制p53活性促進(jìn)宮頸癌增殖[13]。我們發(fā)現(xiàn)，在HCC患者外周血和肝癌組織中TIPE1 mRNA表達(dá)量顯著提高，Ⅲ～Ⅳ期HCC患者的外周血和肝癌組織的TIPE1 mRNA、蛋白表達(dá)均顯著高于Ⅰ～Ⅱ期HCC患者。TIPE1低表達(dá)組HCC患者的OS和RFS優(yōu)于TIPE1高表達(dá)組，說明TIPE1 在肝癌中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，并參與了疾病的進(jìn)程。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-21和TIPE1在HCC患者外周血和肝癌組織中明顯升高，與腫瘤的分化程度關(guān)系密切，與HCC患者生存率具有相關(guān)性，提示 miR-21和TIPE1可能作為HCC潛在預(yù)后評價(jià)指標(biāo)。本次研究主要是臨床樣本的回顧性分析與總結(jié)，對miR-21和TIPE1如何參與調(diào)控HCC的機(jī)制尚不清楚，在今后的研究工作中需要深入探討miR-21和TIPE1參與調(diào)控HCC肝癌發(fā)生發(fā)展的具體分子作用機(jī)制，為肝癌分子診斷與靶向治療提供堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。