楊大業(yè) 唐世磊 李宏武

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 (遼寧 沈陽, 110032)

原發(fā)性肝癌(肝癌)是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、進(jìn)展快、惡性程度高、生存期短等特點(diǎn)。全球每年新發(fā)的原發(fā)性肝癌病例約為78萬例，死亡約74萬例,其中超過一半發(fā)生在我國(guó)[1,2]，手術(shù)、放化療雖能在一定程度上改善肝癌患者的預(yù)后,但許多患者在確診時(shí)就已經(jīng)失去了最佳治療時(shí)機(jī)。因此，研究肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子學(xué)機(jī)制將有助于探尋肝癌的早期診斷與治療的新靶點(diǎn)。

自噬是細(xì)胞通過溶酶體或液泡分解自身組分,以達(dá)到維持細(xì)胞內(nèi)正常生理活動(dòng)和穩(wěn)態(tài)的一種細(xì)胞代謝過程[3]。研究表明,自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著緊密的聯(lián)系。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中能夠通過降解細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等為腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需[4]。腫瘤的存活與增殖可能通過自噬調(diào)節(jié)腫瘤與腫瘤微環(huán)境因素的相互關(guān)系來實(shí)現(xiàn)。因此,通過促進(jìn)或者抑制自噬從而治療腫瘤,已經(jīng)成為攻克腫瘤的新思路[5]。

由于RABs在介導(dǎo)腫瘤自噬及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,因此關(guān)于RABs在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過蛋白免疫印跡技術(shù)(Western Blot)檢測(cè) RAB10蛋白在肝癌組織及正常肝組織中的表達(dá)情況,并對(duì)RAB10的表達(dá)差異與肝癌患者臨床病理資料進(jìn)行相關(guān)性分析，以初步探討RAB10在肝癌組織中表達(dá)的意義以及可能的作用調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 人體組織標(biāo)本 65例人肝癌組織及其配對(duì)正常肝組織由2012年1月至2015年1月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院確診為肝癌經(jīng)手術(shù)治療并經(jīng)患者簽署知情同意書后取得。所有患者術(shù)前均未接受化療及放療。65例中,男46例,女19例;年齡33～78歲,中位年齡62歲,其中40例≤60歲,25例>60歲;腫瘤直徑≤3 cm 37例,>3 cm 28例;術(shù)中或術(shù)后病理提示有淋巴結(jié) 轉(zhuǎn)移癌者20例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌者45例。按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行分期：Ⅰ期+Ⅱ期39例,Ⅲ期+Ⅳ期26例。取肝癌標(biāo)本同時(shí)取正常肝組織標(biāo)本(距離腫瘤>2 cm) 作為對(duì)照。肝癌組織及正常組織標(biāo)本切除后立即應(yīng)用液氮冷凍儲(chǔ)存以供蛋白提取以及免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Westernblot)。組織病理學(xué)評(píng)估均由兩位高年資病理醫(yī)生獨(dú)立觀察, 確診為肝細(xì)胞癌并復(fù)查無誤。所有標(biāo)本檢測(cè)均經(jīng)患者及其家屬同意,并簽署知情同意書。

1.2 Western Blot實(shí)驗(yàn) 取蛋白樣品30 μg放0.5 ml Ep管內(nèi)，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×，混勻后于沸水煮沸5 min使蛋白變性。取蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE,以內(nèi)參GAPHDH作為蛋白上樣量標(biāo)準(zhǔn)品。配置10%分離膠和4%濃縮膠進(jìn)行電泳。恒壓100 V，120 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，小心取出膜至干凈的玻璃瓶皿內(nèi)，以TBST緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl和0.05%Tween 20)洗5 min×3次，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液4度封閉過夜。棄去封閉液，TBST洗5 min×3次，加入抗RAB10多克隆抗體(1∶1 000，Abcom公司)，抗GAPDH 多克隆抗體(1∶2 000,Sigma公司),置4℃過夜。TBST搖床清洗5 min×5次,最后加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗,采用底物增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ECL法顯色,并利用軟件Quantity One(BIO-RAD 公司)進(jìn)行灰度分析。

1.3 TCGA數(shù)據(jù)庫 通過GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)獲取TCGA數(shù)據(jù)庫中RAB10在肝癌組織與正常肝臟組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)并分析RAB10的表達(dá)與無病生存期(DFS)、總生存期(OS)的關(guān)系[7]。此外，我們通過基因表達(dá)的相關(guān)性分析，分析自噬相關(guān)基因(ATG)家族成員在肝癌中與RAB10表達(dá)的相關(guān)性，篩選出與RAB10高表達(dá)明顯相關(guān)的ATG蛋白。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件和GEPIA生存分析功能。RAB10表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)關(guān)系分析采用χ2檢驗(yàn);RAB10表達(dá)與肝癌患者OS、DFS之間的關(guān)系采用Kaplan-Meier法分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAB10蛋白在人肝癌組織和正常肝臟組織中的表達(dá)水平測(cè)定 Western Blot結(jié)果顯示, RAB10蛋白在人肝癌和對(duì)應(yīng)的正常肝臟組織中均有表達(dá),但在肝癌中的相對(duì)表達(dá)水平高于正常組織,見圖 1。

2.2 RAB10的表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析 根據(jù)Western Blot結(jié)果顯示的RAB10在肝癌中的表達(dá)情況,65例肝癌患者分為兩組:RAB10高表達(dá)組(n=35)和低RAB10表達(dá)組(n=30)。表1所示高RAB10表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05),而與年齡、性別無相關(guān)性。

圖1 RAB10蛋白在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)圖

表1 肝癌組織中RAB10的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 RAB10的表達(dá)與肝癌患者生存時(shí)間的關(guān)系 使用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)獲取TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌患者的表達(dá)數(shù)據(jù)并分析RAB10的表達(dá)對(duì)患者OS、DFS的影響。圖2顯示, RAB10在不同分期肝癌中相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異(P<0.001)，RAB10的表達(dá)量越多，腫瘤分期越高。更重要的是,RAB10高表達(dá)患者的OS和DFS顯著低于RAB10低表達(dá)者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05),見圖3。

圖2 RAB10在不同分期肝癌中相對(duì)表達(dá)量圖

圖3 不同RAB10表達(dá)水平的肝癌患者的OS及DFS

2.4 RAB10的表達(dá)與ATG表達(dá)的相關(guān)性 在肝癌組織中，RAB10的高表達(dá)與ATG3、ATG5、ATG6、ATG7的高表達(dá)呈明顯的正相關(guān)(P<0.001)。相關(guān)系數(shù)分別為0.7、0.61、0.6、0.63，其中RAB10的高表達(dá)與ATG3的表達(dá)情況相關(guān)性最強(qiáng)，見圖4。

圖4 RAB10的表達(dá)與ATG3、ATG5、ATG6、ATG7表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

RAB10屬于小型RabGTPase的一種，它作為Ras超家族單體G蛋白的一部分,以在膜轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)中擔(dān)任主配位體而被人熟知[8]。近來研究發(fā)現(xiàn)，RAB10可參與細(xì)胞成分物質(zhì)運(yùn)輸、內(nèi)吞循環(huán)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管形態(tài)及動(dòng)力調(diào)節(jié)等自噬過程[9-11]，尤其在脂質(zhì)吞噬(脂噬)中發(fā)揮活躍作用[12]。近來關(guān)于RAB10在惡性腫瘤中的表達(dá)情況已有相關(guān)報(bào)道，RAB10在肝癌、骨肉瘤、食管鱗癌等惡性腫瘤中可促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲，這種效應(yīng)可被microRNA抑制[13-15]。因此，RAB10與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

本研究選擇了配對(duì)的65例肝癌組織和正常肝組織作為研究對(duì)象，結(jié)果顯示,RAB10蛋白在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肝組織(P<0.05),這說明RAB10蛋白的表達(dá)與肝癌關(guān)系密切。結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫的182對(duì)肝癌患者RAB10的表達(dá)情況對(duì)患者OS、DFS的影響來看，RAB10在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肝組織,且RAB10在不同分期肝癌中相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異，分期越高，RAB10的相對(duì)表達(dá)量也越高，因此RAB10可能參與肝癌異型性的調(diào)控。這似乎提示RAB10在肝癌中的高表達(dá)可促進(jìn)惡性細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,其表達(dá)增加時(shí)肝癌更易于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致預(yù)后不良。

鑒于RAB10在腫瘤自噬，尤其是脂噬過程中發(fā)揮的重要作用，我們通過TCGA數(shù)據(jù)庫篩選了肝癌中與RAB10表達(dá)明顯相關(guān)的ATG。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RAB10與ATG3、ATG5、ATG6、ATG7表達(dá)呈明顯的正相關(guān)，其中與ATG3最相關(guān)(R=0.7)，這說明RAB10與ATG之間可能存在某種關(guān)系的調(diào)控機(jī)制，這有待于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募?xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究來驗(yàn)證和豐富。