楊亞俊 史 英 杜成鋒

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科 (陜西 咸陽， 712000) 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科 3.陜西榆林市星元醫(yī)院檢驗科

自身免疫性肝炎是以免疫介導(dǎo)的肝臟病理損傷和肝功能異常為主要表現(xiàn)的慢性肝病，發(fā)病機制尚未完全明確，與遺傳易感性、免疫調(diào)節(jié)異常及環(huán)境因素有關(guān)[1-4]。臨床上主要通過臨床表現(xiàn)、血液生化指標(biāo)檢測，必要時輔以病理檢測進(jìn)行確診，但檢測耗時繁瑣，影響患者及時判斷病情，因此尋求自身免疫性肝炎特異性指標(biāo)有助于臨床確診。lincRNA在固有免疫及獲得性免疫中發(fā)揮重要作用[5]，Linc00324是近年來研究較為廣泛的lincRNA。本研究前期發(fā)現(xiàn)Linc00324在自身免疫性肝炎患者外周血白細(xì)胞中表達(dá)較高，尤其在CD4細(xì)胞中明顯上調(diào)，猜測Linc00324可能參與自身免疫性肝炎的免疫調(diào)控。因此本研究重點探討Linc00324在自身免疫性肝炎患者中的表達(dá)異常，為臨床確診提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年9月至2019年6月本院消化內(nèi)科經(jīng)臨床確診的自身免疫性肝炎患者55例為自身免疫性肝炎組，男26例，女29例；年齡30～60歲，平均(43.15±5.26)歲?；颊呔献陨砻庖咝苑窝自\斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，均未接受治療，排除遺傳性疾病者、合并感染性疾病者、藥物性肝損傷、酒精性肝損傷、合并惡性腫瘤及其他自身免疫性肝病者。另取同時期體檢健康者61例為正常組，男28例，女33例；年齡30～60歲，平均(43.24±5.10)歲，既往無自身免疫性疾病病史。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)本收集 抽取所有受試者空腹靜脈血5 ml，分成兩管，其中一管-80℃保存；另一管3 000 r/min，-4℃冷凍離心10 min，分離得上清液，-80℃保存。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)法檢測血清Linc00324表達(dá)水平 按照Trizol試劑盒操作說明提取血清標(biāo)本中總RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒Superscript Ⅲ將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Real Master Mix試劑盒并利用SYBR Green Ⅰ染料進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測Linc00324表達(dá)水平，PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min、(95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s)×40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt算法計算Linc00324相對表達(dá)量。以GAPDH為內(nèi)參基因，其引物序列：正向5′-GGGAAUAGUAGCUGUCAAATT-3′，反向5′-UUUGACAGCUACUAUUCCCTT-3′；Linc00324引物序列：正向5′-ACTCTACCTACATCTGGGACACT-3′，反向5′-GTAGGTCCCATGGTCATCCAG-3′。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 生化、免疫指標(biāo)檢測 收集患者入院時肝功能檢測指標(biāo)，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBil)、堿性磷酸酶(ALP)，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)。免疫指標(biāo)包括抗核抗體(ANA)、抗平滑肌抗體(SMA)、抗線粒體抗體(AMA)、免疫球蛋白G(IgG)，由檢驗科生化、免疫室檢測。

1.2.4 免疫細(xì)胞測定 取外周血標(biāo)本，EDTA抗凝后加PE標(biāo)記的鼠抗人CD4+抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD8+抗體各20 μl，渦旋振蕩器混勻，于室溫下避光反應(yīng)15 min，加入溶血素1 ml，室溫避光20 min，加入PBS緩沖液2 ml，離心，棄上清，加入1%多聚甲醛500 μl重懸細(xì)胞，上機檢測CD4+、CD8+T細(xì)胞的比率。上機前常規(guī)對流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，控制儀器各項指標(biāo)在質(zhì)控允許值內(nèi)。上機檢測時首先按照前向散射(FSC)和側(cè)向角散射(SSC)光信號予淋巴細(xì)胞群設(shè)門，每份檢測標(biāo)本獲取設(shè)門內(nèi)10 000個細(xì)胞，檢測后所得數(shù)據(jù)以Listmode文件保存。以CD4+/CD8+細(xì)胞比例作為Th/Ts細(xì)胞比例。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者血清Linc00324表達(dá)及IgG水平情況 見表1。

表1 兩組受試者血清Linc00324表達(dá)及IgG水平情況

2.2 兩組受試者自身抗體陽性率比較 自身免疫性肝炎組ANA陽性率為89.09%(49/55)，SMA陽性率為18.18%(10/55)，AMA陽性率為0。正常組均未發(fā)現(xiàn)ANA、SMA、AMA陽性。ANA陽性(>1∶40)，SMA陽性(>1∶40)，AMA陽性(>1∶100)。

2.3 自身免疫性肝炎患者及正常者肝功能指標(biāo)比較 與正常組相比，自身免疫性肝炎患者血清ALT、AST、TBil、ALP、GGT水平均顯著升高(P<0.05)，見表2。

2.4 兩組受試者免疫細(xì)胞水平比較 與正常組相比，自身免疫性肝炎組患者Th細(xì)胞比例、Th/Ts比值顯著升高(P<0.05)，Ts細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，見表3。

2.5 自身免疫性肝炎患者血清Linc00324水平與各指標(biāo)相關(guān)性 自身免疫性肝炎患者血清Linc00324水平與ALT、AST、ALP、IgG、Th、Th/Ts正相關(guān)(P<0.05)，與Ts負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與TBil、GGT無相關(guān)性(P>0.05)，見表4。

表2 兩組受試者肝功能指標(biāo)比較

表3 兩組受試者免疫細(xì)胞水平比較

表4 自身免疫性肝炎患者血清Linc00324水平與各指標(biāo)相關(guān)性

2.6 血清Linc00324水平對自身免疫性肝炎的診斷作用 ROC曲線顯示，血清Linc00324水平診斷自身免疫性肝炎的曲線下面積為0.795，截斷值為2.031，敏感度為78.2 %，特異度為81.3 %，見圖1。

圖1 血清Linc00324水平對自身免疫性肝炎的診斷ROC曲線

3 討論

自身免疫性肝炎是自身免疫性肝病中最常見的類型，其性別、年齡分布與紅斑狼瘡類似，其發(fā)病與自身免疫功能失調(diào)密切相關(guān)[7]。隨著醫(yī)學(xué)進(jìn)展，人們對自身免疫性肝炎研究更加深入。研究顯示，自身免疫性肝炎患者血清內(nèi)出現(xiàn)大量自身抗體，提示自身抗體的升高促進(jìn)自身免疫性肝炎的發(fā)生[8]。探索加速自身免疫性肝炎發(fā)展的因素，可為判斷自身免疫性肝炎的發(fā)生及延緩疾病進(jìn)程提供理論依據(jù)。

LincRNA本身不可被翻譯為蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)與mRNA類似，在染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活等多種生物學(xué)過程中存在調(diào)控作用，LincRNA對獲得性免疫和固有免疫均有一定影響[9]。Yang等[10]研究顯示，lincRNA MALAT-1在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中高表達(dá)。Linc00324位于人17p13.1[11]。本研究中自身免疫性肝炎患者外周血血清Linc00324表達(dá)顯著高于正常者，提示Linc00324可能參與自身免疫性肝炎的發(fā)病過程。

當(dāng)某些特異性的抗原物質(zhì)(病毒、細(xì)菌等)與人體組織具有類似的抗原結(jié)構(gòu)時，天然免疫耐受狀態(tài)被打破，發(fā)生針對自身肝組織抗原的免疫應(yīng)答及異常反應(yīng)，造成自身肝組織損傷和炎癥，引發(fā)自身免疫性肝炎[12]。研究顯示，免疫調(diào)節(jié)失衡是引起自身免疫性肝炎的原因之一，當(dāng)Ts細(xì)胞功能過低或Th細(xì)胞過度時，會導(dǎo)致自身抗體的產(chǎn)生[13]。Stashenko等[14]研究顯示，Sprague-Dawley大鼠中隨著鼠齡的增長Ts細(xì)胞明顯減少，而Ts細(xì)胞功能的過早降低，可導(dǎo)致過量自身抗體出現(xiàn)，誘發(fā)與人類系統(tǒng)性紅斑狼瘡類似的自身免疫性疾病。本研究中，自身免疫性肝炎患者較健康者Th/Ts細(xì)胞比例上升，提示Th/Ts比例失衡可能參與自身免疫性肝炎病變過程。

自身免疫性肝炎患者肝功能嚴(yán)重受損，以血清AST、ALT水平升高為主要特征[15]。本研究中自身免疫性肝炎患者肝功能指標(biāo)血清AST、ALT、TBil、ALP、GGT水平顯著高于正常人，提示患者肝功能受損嚴(yán)重。自身抗體表現(xiàn)異常在自身免疫性肝炎中較為常見。Wang等[16]研究顯示，幾乎所有自身免疫性肝炎患者均有一種或多種自身抗體明顯升高，多數(shù)患者為ANA或SMA陽性，偶爾可見抗線粒體抗體陽性。本研究55例自身免疫性肝炎患者中ANA陽性49例(89.09%)，SMA陽性10例(18.18%)，提示自身免疫性肝炎患者最常見的自身抗體為ANA和SMA，未見AMA陽性，可能是研究樣本量較少。AMA和SMA均非自身免疫性肝炎的特異性指標(biāo)，在原發(fā)性膽汁性膽管炎、脂肪肝及其他自身免疫性疾病中也存在AMA和SMA抗體陽性，臨床診斷需結(jié)合其他檢查。此外Pearson分析顯示自身免疫性肝炎患者血清Linc00324水平與AST、ALT、ALP、IgG及Th/Ts均存在相關(guān)性，提示血清Linc00324水平與疾病活動密切相關(guān)，猜測Linc00324可能通過影響免疫系統(tǒng)平衡參與自身免疫性肝炎發(fā)生，具體機制有待進(jìn)一步研究。進(jìn)一步ROC分析顯示血清Linc00324水平對診斷自身免疫性肝炎的曲線下面積為0.795，特異度與敏感度分別為81.3%,78.2%，提示血清Linc00324可能能作為診斷自身免疫性肝炎的生物學(xué)指標(biāo)，截斷值為2.031，表明Linc00324水平高于2.031者發(fā)生自身免疫性肝炎的風(fēng)險高，為臨床及科研人員對自身免疫性肝炎研究及治療提供了靶點。

綜上所述，自身免疫性肝炎患者血清Linc00324高表達(dá)，與臨床肝功能指標(biāo)、免疫細(xì)胞水平密切相關(guān)，可能成為自身免疫性肝炎的診斷標(biāo)志物。但本研究也存在一定不足，選取樣本量較少，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本。