武帥

摘 要：為了更好的檢測人體血清中尿素含量，為臨床醫(yī)學病情診斷提供技術(shù)支持，本文提出ILD-LCMS/MS的人體血清尿素含量測定方法。對此，本研究在傳統(tǒng)ID-GC/MS檢測方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合同位素稀釋質(zhì)譜法對樣品數(shù)據(jù)進行處理，從而保證數(shù)據(jù)處理的準確性。試驗結(jié)果表明，該方法的回收率和精密度低，且線性范圍和檢出限在合理范圍內(nèi)。最后將測定的結(jié)果與血清標準物質(zhì)濃度進行對比，總的相對偏差都低于1%，證實了該方法的可行性。

關(guān)鍵詞：血清;尿素;LD-LCMS/MS;同位素稀釋質(zhì)譜法

中圖分類號：TQ441 文獻標識碼：A 文章編號：1001-5922（2021）07-0029-05

Study on the Determination of urea in Human Serum

Wu Shuai

（Clinical Laboratory， Bei qing lu Outpatient Department， Jing bei Medical District，

PLA General Hospital， Bei Jing 100094， China）

Abstract：In order to better detect the urea content in human serum and provide technical support for clinical medicine and disease diagnosis， this paper proposes the ILD-LCMS/MS method for the determination of human serum urea. In this regard， this study is based on the traditional ID-GC/MS detection method， combined with isotope dilution mass spectrometry to process the sample data， so as to ensure the accuracy of data processing. The test results show that the recovery rate and precision of this method are low， and the linear range and detection limit are within a reasonable range. Finally， the results of the determination were coMPared with the concentration of serum standard substances， and the total relative deviation was less than 1%， which confirmed the feasibility of the method.

Key words：serum; urea; LD-LCMS / MS; isotope dilution mass spectrometry

人體的血清中含有多種元素， 醫(yī)學常用通過檢測血清中元素的含量來檢查病人身體健康情況。血清中尿素、尿酸及肌酐的測定能夠給臨床醫(yī)學、病情診斷提供重要參考。目前用來測定血清中尿素、尿酸及酸酐的方式有很多，但為了檢驗結(jié)果的準確性，確立標準可靠地標準化參考方法。血清中尿素測量的液相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法原理可靠、前處理簡單且定量準確，是目前血清中尿素測量較為重要的一種候選參考方法，本文通過設置實驗，進行實驗，驗證結(jié)果的過稱確定此方法的可行性，為血清中尿素標準檢驗物質(zhì)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 設備與試劑

1.1.1 儀器的選擇

美國安捷倫公司生產(chǎn)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀6410B;德國梅特勒公司生產(chǎn)的天平ME235S，Max=230g，d=0.01mg;天平METTLERTOLEDOUMX2，Max=2.1g，d=0.1μg;北京醫(yī)用離心機廠生產(chǎn)的離心機LD5-2A;德國Brand生產(chǎn)的移液器：1000μL、200μL、20μL;美國ScientificIndustries生產(chǎn)的漩渦振蕩器VOREX-2GENIE;中國和利生產(chǎn)的超低溫冰箱。

1.1.2 血清樣品

本次實驗選擇的血清樣品是由軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所提供的冰凍混合人體血清。血清標準物質(zhì)為標準物質(zhì)SRM909b標準I，人血清干粉，美國NIST。

1.1.3 實驗試劑

美國生產(chǎn)的尿素標記物Urea-13c，15N2，純度99atom%13C，98atom%15N，Sigma;國家標準物質(zhì)研究中心提供的標準物質(zhì)：GBW09201，純度為99.9%，不確實度為0.2%，K=2;德國Merck生產(chǎn)的甲醇：高效液相色譜級、乙腈：高效液相色譜級;實驗用水為高純?nèi)嗡∕illipore，0.22μm）。

1.2 研究方法

本文采用的研究方法為液相色譜/大氣壓電離質(zhì)譜法。目前實驗常用方法為氣相色譜質(zhì)譜法，但該方法需要經(jīng)過復雜的衍生化反映才能進行氣相色譜分析。而樣品衍生過程分為2個步驟：①將尿素轉(zhuǎn)化為2-羥基嘧啶衍生物，②利用甲基硅烷化作用。但該種方法有個弊端就是尿素衍生物在短時間內(nèi)不穩(wěn)定，易分解，可能導致色譜峰拖尾。也就是說該種方法樣品前處理過于復雜及費時，故此次實驗不采用此種方式。本次實驗采用的液相色譜/大氣壓電離質(zhì)譜法是基于Tetsuya Tamgawa，Yasuo Mlzo-oku，Kouichi Morlguchi，Takahiko Osumi和Masaaki Odomi建立的。該方法的特點在于直接使用高效液相色譜直接在尿素中定性定量分析，樣品前處理簡單，且檢測結(jié)果準確和精密度皆在可接受范圍以內(nèi)。

1.3 實驗過程

1.3.1 實驗溶液配置及樣品預處理

（1）標準溶液配置。尿素標準溶液配置：根據(jù)實驗所需濃度計算所需尿素標志物質(zhì)量及水溶液體積（在計算時需考慮標準物質(zhì)純度），精準稱取實驗所需質(zhì)量精純尿素標準物質(zhì)融于標準體積水溶液，通過煮沸后冷卻至室溫完成配置過程。

尿素標記物標準溶液配置：根據(jù)實驗所需濃度計算所需尿素標記物13C，15N2質(zhì)量及水溶液體積（在計算時需考慮標記物純度），精準稱取實驗所需質(zhì)量精純尿素標記物13C，15N2融于標準體積水溶液，通過煮沸后冷卻至室溫完成配置過程。

以上標準溶液配置完成以后分裝，密封后置于實驗用超低溫空間中，-20℃的環(huán)境保存。

（2）校準比值混合溶液配置。據(jù)常規(guī)方法測定的血清樣品中的大致濃度，用微量移液器將一定體積尿素標記物溶液取出，然后加入到一定體積的尿素標準溶液。使得校準比值溶液中尿素質(zhì)量與標記物質(zhì)量比分別為：0.8、0.9、1.1、1.2.配置好校準比值混合溶液后用進度為d=0.01mg的天平稱量，并且記錄讀書，將室溫下充分混勻，保持平衡。

（3）血清樣品制備。將血清樣本從超低溫冰箱取出放置，待樣本在室溫條件下恢復平衡以后，稱取一定質(zhì)量的血清，再稱取前需要先輕搖混勻，避免產(chǎn)生氣泡造成影響。根據(jù)之前測定的血清樣本里尿素的大致濃度向樣品中加入一定體積的尿素13C，15N2標記溶液，使得溶液中尿素含量與標記物含量比值接近1∶1，將混合后的溶液稱量，記錄讀數(shù)，輕搖混勻。

將加入標記物以后的血清樣本放置在室溫下平衡一個小時左右，在平衡后的溶液中加入一定體積的乙腈試劑，使該溶液里血清為乙腈的1/3?；旌暇鶆?，靜置沉淀蛋白質(zhì)。將沉淀后的溶液取上層清液用乙腈稀釋，稀釋至1μg/g后，用0.22μg/g的有機濾膜過濾，放入2mL樣品瓶中，進行ID-LC/MS/MS分析。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理

將樣品制備好以后，就可以計算血清濃度了。本文采用的是括號法，括號法的數(shù)學模型為圖1所示。計算公式為：

式中，c代表血清中尿素質(zhì)量濃度，單位為μg/g;mpike代表加入血清中的尿素標記物質(zhì)量，單位為μg;mserum代表血清樣品的質(zhì)量，單位為g;RAS代表樣品中尿素與尿素標記物面積比;RAL代表低標中尿素與尿素標記物面積比;RAH代表高標中尿素與尿素標記物的面積比;RML代表低標中尿素與尿素標記物的質(zhì)量比;Rmh代表高標中尿素與尿素標記物的質(zhì)量比。

1.3.3 實驗環(huán)境

（1）沉淀劑用量。在確定樣品之前，我們做了多組實驗。分別往標記物標準溶液里面加入一定體積的乙腈，使得乙腈與標準溶液里面的血清體積比分別為2∶1、3∶1、4∶1;觀察里面的蛋白質(zhì)沉淀情況。經(jīng)過對混合溶液的觀察分析，當乙腈與血清的體積比為3∶1時，分層明顯，上層溶液澄清，能夠完全看清蛋白質(zhì)沉淀。當體積比為2∶1時，溶液呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，當體積比為4∶1時，沉淀效果變化不大，故最適合用于實驗的乙腈與血清體積比例為3∶1。

（2）色譜條件。色譜柱的選擇：為了達到最好的實驗結(jié)果，本次實驗開始之前，對比了4種色譜柱，分別是：AgilentZORBAXRX-SIL4.6×150mm，5μm;AgilentZORBAXSB-Aq2.1×150mm，3.5μm;DikmaInertsilODS-SP2.1×150mm，5μm;VenusilMPC-18100A4.6×150mm，5μm。通過實驗對比發(fā)現(xiàn)，尿素在AgilentZORBAXRX-SIL4.6×150mm，5μm上保留程度較大，故此次實驗選擇的是AgilentZORBAXRX-SIL為分析柱。

流動相的選擇：為了選擇出最適合的流動相，本次實驗對比了甲醇/水體系及乙腈/水體系。使用甲醇/水體系時，尿素在色譜柱上保留力度較?。ˋgilent ZORBAX RX-SIL 2.1×150mm，5μm，有機相/水相=95/5，0.2mL/min，保留時間2.5min）;當使用乙腈/水體系時，尿素在色譜柱上保留力度較大，（Agilent ZORBAX RX-SIL2.1×150mm，5μm，有機相/水相=95/5，0.2mL/min，保留時間6.8min）。

流動相比例的優(yōu)化：為了得到最適合的流動相比例，本實驗分別對比了乙腈/水體積=95/10、95/5、98/2時的狀況，實驗表明，當乙腈/水體積比為95/5時，尿素與基底物質(zhì)中的其他物質(zhì)能夠很好的分離，且保留時間比較合適，峰形較好，用來作為流動相正合適。

通過以上3個實驗，選擇最適合的色譜條件為，色譜柱：Agilent ZORBAX RX-SIL（2.1×150mm，5μm）;流動相：乙腈/水=95/5（V/V）;流速：0.2mL/min;進樣量：2μL;色譜柱溫度：30℃。

（3）質(zhì)譜條件。為了得到最適合的質(zhì)譜條件，在實驗開始前，先對質(zhì)譜進行一定分析。在全掃描（TIC）模式下，尋找分子離子峰。提取離子為尿素m/z61.1，內(nèi)標m/z。在確定母離子后，選擇反應監(jiān)測（SIM）模式下優(yōu)化Fragmentor參數(shù)，對比Fragmentor在60V、80V、100V、120V時質(zhì)譜信號的響應，發(fā)現(xiàn)在60V時，質(zhì)譜響應最大，故確定60V為Fragmentor參數(shù)。

在子離子掃描（Product Ion）模式下，尋找尿素及內(nèi)標的子離子，經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，內(nèi)標離子分別為44.0、46.0時最適合。質(zhì)譜碎裂機理為尿素及尿素標記物分子離子與中性碰撞氣-氨氣碰撞后，分別失去一個氨基，從而得到子離子。

在確定母離子和子離子以后，在多重反應監(jiān)測（MRM）模式之下發(fā)生優(yōu)化碰撞（Collision Energy，CE），不同CE下質(zhì)譜響應為表1、表2，通過觀察，在CE為20時，質(zhì)譜響應最大，即將其確定為CE參數(shù)。

綜合上述實驗結(jié)果，本實驗所用質(zhì)譜條件為離子源：ESI（+）;數(shù)據(jù)采集時間為5min;掃描時間為200ms;MRM為m/z=61.1-44.0和64.1-46.0（尿素標記物）;干燥氣溫度為350℃;干燥氣流速：9L /min;Nebulizer為40psi;Fragmentor為60V;CE為20V;Delta EMV為200V。

1.4 分析過程

將4個調(diào)試好的校準比值混合溶液以從低到高的順序進樣，為了測量結(jié)果的準確，每個校準比值混合溶液需要重復測定3次。將尿素與尿素標記物的面積比值作為此次實驗的評定標準。注意，如果所得結(jié)果的RSD超過了1%，就需要重新測定。如果尿素與尿素標記物質(zhì)量筆峰面積比圖像曲線的線性回歸系數(shù)的平方小于0.999，也需要重新測定。

每個血清樣品與它的一對標準同一批測定，在分析的時候，以高標、樣品、低標、樣品、高標、樣品、低標次序進樣。即每個樣品都與其相鄰的低標和高標對比校準，這樣就能保證結(jié)果的RSD在1%以內(nèi)。將實驗所得結(jié)果均值作為此次實驗的有效數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的精密度

為了監(jiān)測此種方法的精密度，本文應用實驗方法測定3種不同濃度的血清。將每種濃度、每個批次平均分為3次，進行平行測定。將結(jié)果進行統(tǒng)計分析，最后得出結(jié)論：該實驗RSD值均小于1.0%，具有較好的精密度，如表3所示。

2.2 回收率

本次實驗時以低濃度血清為研究對象，在加入一定量的尿素標準溶液 以后，運用該實驗方法測定血清尿素濃度，以此研究該方法的回收率和準確性。濃度為1507.466μg/g血清中尿素標準溶液加入量分別為100μL和200μL。將配好的溶液做3個平行樣品進行測定，共測定了兩批，測定回收率分別為98.0%～102.3%和97.9%～101.1%。如表4所示。

2.3 線性范圍和檢測限

為了得到最準確的結(jié)果，本次實驗以尿素與尿素標記物的質(zhì)量比對峰面積比做回歸分析。通過分析結(jié)果可知，在100～3000μg/g的范圍內(nèi)，尿素與尿素標記物的質(zhì)量比與峰面積比呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系?；貧w方程為Y=0.881x-0.014，R2為0.99998。

2.4 方法的驗證

為了確定此方法的準確性，用該方法檢測美國NIST血清標準物質(zhì)SRM 909b水平I兩次，且每次測試都需重復檢測4次，測定的結(jié)果在標準范圍以內(nèi)，證實了該方法的準確度。

3 定值結(jié)果

為了確定該方式在實際生活中的應用，用本文所建立的方式分別對兩個水平的人血清中尿素標準物質(zhì)進行定值。將結(jié)果統(tǒng)計如表5、表6所示。

4 結(jié)論

文章設立的利用LD-LCMS/MS測定人體血清中尿素含量的方法相對于傳統(tǒng)ID_GC/MS法，前處理過程得到了較大簡化。利用乙腈/水體系作為流動相，使得尿素在色譜柱上保留時間及保留力度都較強，且不需要緩沖鹽，適用于質(zhì)譜的分析。選擇了同位素稀釋質(zhì)譜法能夠保證該方法的高準確度與溯源性。在數(shù)據(jù)處理過程中，選用了括號法矯正質(zhì)譜儀的波動，保證了數(shù)據(jù)的準確度。并且利用實驗驗證回收率及線性范圍，將測定結(jié)果與國際標準不確定度對比，檢測該方法的準確度。最后應用這個方式對兩種濃度的血清標準物質(zhì)進行檢測，檢測結(jié)果與標準結(jié)果只偏差0.32%和0.22%。綜上分析，建立的血清尿素測定方式相對傳統(tǒng)血清檢測方式更為簡單快速，且定量準確，有望成為檢測血清中尿素的參考方法，并且為后續(xù)血清尿素標準物質(zhì)的研究提供支持。

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