孫敬爽 胡瑞陽(yáng) 鄭廣順 麻文俊 許言 王軍輝

（1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心 楸樹(shù)國(guó)家創(chuàng)新聯(lián)盟 北京 102300；2. 林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家林草局森林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 楸樹(shù)國(guó)家創(chuàng)新聯(lián)盟 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)所 北京 100091）

遺傳轉(zhuǎn)化是植物功能基因組研究和分子育種的核心工作之一，發(fā)展高效、安全的新型遺傳轉(zhuǎn)化方法，一直是基因工程、分子生物學(xué)和遺傳育種等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一［1］。傳統(tǒng)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，主要通過(guò)根癌農(nóng)桿菌侵染、基因槍轟擊和病毒侵染等轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)基因植株。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于擬南芥、煙草等模式植物和一二年生草本植物或園藝植物。但對(duì)于木本植物或頑拗型基因型的植物來(lái)說(shuō)，仍存在遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)難題，獲得轉(zhuǎn)基因植株仍非常困難。例如，林木轉(zhuǎn)基因研究主要集中于楊樹(shù)（Populus tremula×Palba.）［2］、火炬松（Pinus taeda）［3］、刺槐（Robinia pseudoacacia）［4］、白云杉（Picea glauca）［5］、白樺（Betula platyphylla）［6］、落葉松（Larix gmelinii）［7］等20 多個(gè)樹(shù)種。大多數(shù)林木中克隆的功能基因只能轉(zhuǎn)化到擬南芥和煙草等模式植株中進(jìn)行分析驗(yàn)證，從而嚴(yán)重限制了植物分子育種以及基因功能的有效研究。

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米粒子作為基因載體已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和基因治療等領(lǐng)域［8-10］。因納米載體具有大比表面積可高效負(fù)載基因、生物兼容性強(qiáng)可保護(hù)負(fù)載基因、毒性小安全性高等特點(diǎn)［11-12］。2007 年，Torney 等［13］首次利用介孔氧化硅納米載體裝載基因轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞并獲得成功，實(shí)現(xiàn)了納米載體介導(dǎo)基因在植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并逐漸發(fā)展成為一類具有創(chuàng)新性的高效植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)［14-15］。本研究根據(jù)納米粒子特性介紹已應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的納米基因載體類型、與外源基因的結(jié)合方式及傳輸細(xì)胞的原理，并重點(diǎn)介紹影響納米載體性能的因素以及轉(zhuǎn)化植物的方法，分析了與早前轉(zhuǎn)基因方法的區(qū)別和優(yōu)勢(shì)，并對(duì)納米載體介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化存在的問(wèn)題和發(fā)展前景進(jìn)行了探討，期望為植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和方法提供新的思路。

1 納米基因載體

納米基因載體是一類由生物兼容性性材料通過(guò)分子自組裝的方法制備而成，用于運(yùn)載基因的納米微囊或納米粒子的總稱［16］。通過(guò)納米載體表面修飾相應(yīng)基團(tuán)，使其以物理或化學(xué)親和作用包裹或吸附外源DNA 等核酸分子，從而形成納米基因載體復(fù)合物，通過(guò)化學(xué)鍵或靜電吸附作用與細(xì)胞表面受體結(jié)合，利用細(xì)胞胞吞作用實(shí)現(xiàn)基因的靶向運(yùn)輸［17］。

1.1 納米基因載體的分類

納米基因載體從形態(tài)特征上分為納米粒、納米球、納米囊、納米孔及納米片層等多種形態(tài)；從材料來(lái)源可以分為無(wú)機(jī)物納米材料、天然高分子納米材料和有機(jī)合成高分子納米材料等［18］（圖1）。

目前應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的納米基因載體以無(wú)機(jī)物納米材料為主（表1），包括以四氧化三鐵（Fe3O4）構(gòu)建的磁性納米粒子（Magnetic nanoparticles，MNP），以二氧化硅骨架構(gòu)成的介孔二氧化硅納米載 體（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）， 以碳原子構(gòu)成的單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳納米管（Multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）等納米材料構(gòu)成的納米載體。無(wú)機(jī)物納米材料制作簡(jiǎn)單，可在水溶液中通過(guò)共沉淀或氧化共沉淀制備，合成重復(fù)性好，并根據(jù)反應(yīng)條件調(diào)節(jié)納米顆粒的粒徑大小、形狀和組成；且無(wú)機(jī)納米材料作為基因載體具有生物親和性好、免疫排斥反應(yīng)低、降解后毒副反應(yīng)小，可有效保護(hù)核酸免受核酸酶的降解等優(yōu)勢(shì)［19-20］。

其次以殼聚糖（Chitosan，CHS）、淀粉（Starch nanopaticls，StNP）和細(xì)胞穿膜肽（Cell penetrating peptides，CPPs）的天然高分子材料制備的納米載體，以及由磷酸鈣（Calcium phosphate，CaP）、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（Dimethylaminoethyl methacrylate，DMAEM）聚合物、聚酰胺型樹(shù)枝狀聚合物（Polyamidoamine，PAMAM）、多聚賴氨酸（Poly-l-lysine，PLL）、聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）等人工合成的高分子材料作為植物基因載體也有少量應(yīng)用［21］。天然高分子有機(jī)納米材料來(lái)源容易，具有無(wú)毒抗菌、生物相容性好及生物易降解等特點(diǎn)；合成的高分子有機(jī)納米材料合成制備相對(duì)容易，可規(guī)?；a(chǎn)，具有良好的分散性、易于表面修飾、穿透膜能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。

1.2 納米基因載體與DNA等核酸的結(jié)合方式

納米粒子的小尺寸效應(yīng)，大比表面積效應(yīng)以及表面較強(qiáng)的物理化學(xué)活性使其能夠負(fù)載多種不同類型的核酸分子，如DNA、siRNA、miRNA、dsRNA、蛋白和核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）等［22］。無(wú)機(jī)類納米粒子可以直接結(jié)合DNA 等核酸分子，但由于負(fù)載效率低，需要對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行陽(yáng)離子聚合物或氨基硅烷化修飾，才能有效吸附與運(yùn)輸核酸分子。例如，介孔二氧化硅納米載體是在多孔硅納米顆?；蛘邭?核型中空二氧化硅表面經(jīng)過(guò)表面氨基化，通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)作用與核酸分子形成納米載體基因復(fù)合物［23］；磁性納米載體可以通過(guò)表面改性與多種功能基團(tuán)修飾，如-NH2、-CHO、-COOH 和-OH等，使納米載體能夠通過(guò)靜電作用、化學(xué)偶聯(lián)作用、配體反應(yīng)等物理或化學(xué)親和方式負(fù)載結(jié)合核酸分子［24-25］。而有機(jī)高分子形成的納米粒子，由于其表面負(fù)載氨基而帶正電荷，可以直接與帶負(fù)電荷的DNA 等核酸分子通過(guò)靜電吸附作用結(jié)合，使核酸分子由蓬松與分散狀態(tài)濃縮至納米顆粒中，形成體積小、形狀規(guī)則的納米基因載體復(fù)合物［26-27］。

圖1 應(yīng)用于植物或動(dòng)物外源基因轉(zhuǎn)化的常見(jiàn)納米粒子（引自［41］）

1.3 納米基因載體復(fù)合物傳輸細(xì)胞的原理

目前，納米作為基因載體傳輸細(xì)胞的原理研究還相對(duì)較少。納米載體基因復(fù)合物主要通過(guò)3 種途徑穿越植物細(xì)胞壁屏障：（1）通過(guò)一定的外力在細(xì)胞上形成可逆的瞬間通道，使納米載體基因復(fù)合物直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部［13，28］；（2）利用納米粒子的功能修飾，如利用帶陽(yáng)離子肽聚合物的修飾，與細(xì)胞壁上受體的相互作用來(lái)擴(kuò)大細(xì)胞壁的孔徑以提高納米粒子的攝入［29］；（3）納米載體基因復(fù)合物利用細(xì)胞壁的孔隙直接通過(guò)細(xì)胞壁，如花粉粒的花粉孔、葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞孔隙［30］。

跨越細(xì)胞壁后，納米載體基因復(fù)合物主要是通過(guò)細(xì)胞的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。納米載體基因復(fù)合物表面多余的電荷使其以被動(dòng)的形式快速黏附在細(xì)胞膜表面，繼而通過(guò)細(xì)胞的胞吞作用或攝取作用進(jìn)入細(xì)胞［31］。細(xì)胞膜內(nèi)陷形成內(nèi)含體包裹納米載體基因復(fù)合物，并被細(xì)胞內(nèi)的溶酶體吞噬［32］。在溶酶體內(nèi)，納米載體上的陽(yáng)離子基團(tuán)不斷置換質(zhì)子，抑制pH 降低，使質(zhì)子不斷泵入溶酶體，導(dǎo)致溶酶體裂解，最終納米載體基因復(fù)合物通過(guò)質(zhì)子-海綿效應(yīng)的過(guò)程逃逸出溶酶體，釋放在細(xì)胞胞漿內(nèi)［33］。但也有研究認(rèn)為，一些納米粒子，如LDHs 負(fù)載外源基因通過(guò)非胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，典型的內(nèi)吞抑制劑和低溫孵育不能阻止LDHs 的內(nèi)吞，LDHs 是直接跨越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，這種特性可能拓寬其在多種植物中的應(yīng)用［34］。

從溶酶體釋放的納米載體基因復(fù)合物擴(kuò)散到核膜表面，有兩種情況從核孔進(jìn)入細(xì)胞核，一種是納米載體與核酸分子在細(xì)胞核外解離，核酸分子單獨(dú)進(jìn)入細(xì)胞核；另一種是納米載體基因復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)部解離，核酸分子與植物細(xì)胞的基因發(fā)生重組［35-37］；然而對(duì)于納米載體介導(dǎo)的外源基因進(jìn)入核細(xì)胞與染色體的整合情況，如外源基因的拷貝數(shù)與整合位點(diǎn)等方面研究仍不清楚，是否類似于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA 與染色體基因組的整合機(jī)理，目前還未見(jiàn)報(bào)道。

表1 介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化的納米載體類型、特性、功能修飾、轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞途徑及基因表達(dá)情況

表1 續(xù)表

2 影響納米基因載體性能的重要因素

納米載體的粒徑、形狀、表面電荷、修飾的功能基團(tuán)以及細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境等都會(huì)影響其負(fù)載外源基因、細(xì)胞攝入和基因表達(dá)效率的重要因素［38-39］。

2.1 納米載體粒徑

納米載體的粒徑是影響外源基因轉(zhuǎn)化效率的重要因素。不同于動(dòng)物，植物具有細(xì)胞壁這一天然屏障，納米載體負(fù)載外源基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞核或原生質(zhì)體需要通過(guò)細(xì)胞壁和質(zhì)膜等屏障。植物細(xì)胞壁排除外源物的極限為5-20 nm［40］，植物細(xì)胞、細(xì)胞核或細(xì)胞膜的限制范圍為300-500 nm，阻止較大的外源分子進(jìn)入［41］。納米粒子是一類一維粒徑至少小于100 nm 的物質(zhì)，然而研究表明納米粒徑在20-100 nm 范圍內(nèi)，具有較強(qiáng)的穿透性，既有利于納米粒子攜帶外源基因，經(jīng)細(xì)胞攝取而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，又不因過(guò)小而被過(guò)濾清除掉［42］。

2.2 納米載體結(jié)構(gòu)

納米載體結(jié)構(gòu)不同，負(fù)載外源基因的形式不同。如球狀納米載體，外源基因一般負(fù)載在表面；多孔納米載體，外源基因多數(shù)負(fù)載在其孔內(nèi)；層狀納米顆粒，外源基因負(fù)載在其片層內(nèi)等。目前，不同類型的納米負(fù)載外源基因的效果，以及外源基因傳輸細(xì)胞與轉(zhuǎn)化效率未見(jiàn)系統(tǒng)的比較。但有研究發(fā)現(xiàn)，以siRNA 作為外源基因，不同納米結(jié)構(gòu)形成的納米載體復(fù)合物轉(zhuǎn)入細(xì)胞的效率與細(xì)胞內(nèi)基因沉默的效果相關(guān)，siRNA 負(fù)載在三維結(jié)構(gòu)納米載體中，能夠使內(nèi)源基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都沉默。但是負(fù)載在一維結(jié)構(gòu)納米載體中，只會(huì)使其在蛋白水平上發(fā)生沉默而在轉(zhuǎn)錄水平卻得到了提高，說(shuō)明納米不同結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入外源基因的原理可能不同［43］。

2.3 納米載體表面修飾

納米粒子富有活性的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以直接結(jié)合核酸分子，也可以通過(guò)不同基團(tuán)修飾后再結(jié)合核酸分子，形成納米載體-基因復(fù)合物［44］。納米粒子經(jīng)親水性物質(zhì)（如聚乙烯醇、聚乙烯亞胺、多聚賴氨酸等）表面修飾后，可以提高其在分散體中穩(wěn)定性，增加與細(xì)胞膜的結(jié)合力［37，45-46］；經(jīng)過(guò)糖類物質(zhì)（如殼聚糖、環(huán)糊精等）修飾的納米粒子，能增加納米載體對(duì)基因的負(fù)載量，增加復(fù)合物電位值Zeta，提高穿越細(xì)胞膜等生物屏障能力，并且提高轉(zhuǎn)基因的靶向性［47-48］。例如，以羧基化殼聚糖負(fù)載的CSCOVSWNTs 負(fù)載外源基因進(jìn)行煙草植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與其他修飾SWNTs 相比，CSCOV-SWNTs 不僅具有更多可用的殼聚糖鏈負(fù)載基因，而且CSCOV-SWNTs 具有更高的C-C 共價(jià)鍵（～88 kcal/mol），電位Zeta（37.6 mV）明顯高于其他修飾，可以安全地?cái)y帶外源基因通過(guò)生物屏障和細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部，提高轉(zhuǎn)化效率［49］。另外，納米粒子在經(jīng)表面活性劑（如葡聚糖、聚山梨脂和膽固醇等）修飾后，也可以保護(hù)外源分子免受降解，提高細(xì)胞對(duì)納米載體攝取效率［50］。

2.4 環(huán)境條件

盡管大多數(shù)納米粒子與外源基因結(jié)合方式比較溫和，在室溫條件下（25-35℃）孵育15-30 min 即可結(jié)合形成納米載體基因復(fù)合物［24，49，51］。但研究發(fā)現(xiàn)，納米載體基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率是與其濃度、共孵育溫度、時(shí)間及pH 相關(guān)。在一定范圍內(nèi)增加納米載體基因復(fù)合物濃度，延長(zhǎng)與懸浮細(xì)胞的共培養(yǎng)時(shí)間，都可以有效增加外源分子在植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；植物細(xì)胞攝取納米載體依賴一定溫度條件，研究發(fā)現(xiàn)在4℃條件下共培養(yǎng)，即使共孵育時(shí)間延長(zhǎng)24 h 細(xì)胞內(nèi)部也沒(méi)有納米粒子負(fù)載的熒光信號(hào)［52］；另外，利用植物細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的 pH 差異可以實(shí)現(xiàn)靶向轉(zhuǎn)基因，植物細(xì)胞質(zhì)pH 值在5.5 左右，而葉綠體的pH 在8.0 左右［53］，研究發(fā)現(xiàn)以殼聚糖修飾的單壁碳納米管設(shè)計(jì)為在細(xì)胞外弱酸條件，pDNA 可以與單壁碳納米管緊密結(jié)合，而在葉綠體弱堿環(huán)境中，pDNA-SWNT 的結(jié)合能力明顯減弱，可以使pDNA 在葉綠體中有效釋放，從而實(shí)現(xiàn)納米載體負(fù)載外源基因在葉綠體質(zhì)體的靶向轉(zhuǎn)基因［49］。因此，如何通過(guò)利用植物細(xì)胞不同結(jié)構(gòu)的pH 差異設(shè)計(jì)納米載體，實(shí)現(xiàn)靶向轉(zhuǎn)基因是今后重要研究方向。

3 納米載體-基因復(fù)合物的在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化方法

目前利用納米粒子形成的納米載體-基因復(fù)合物，通過(guò)磁轉(zhuǎn)染、PEG 轉(zhuǎn)染等外力以及直接轉(zhuǎn)化的方式，將外源基因轉(zhuǎn)入玉米胚［13］、盾葉薯蕷愈傷組織懸浮液［46］、芥菜、煙草原生質(zhì)體或葉子［54］和擬南芥根［26，55］等多種植物組織或器官（表1）。

3.1 借助外力轉(zhuǎn)化方法

借助合適的載體和外力可以提高納米載體-基因復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核的數(shù)量［14］，易形成穩(wěn)定的植物遺傳轉(zhuǎn)化（表1）。Torney 等［13］4 位博士利用蜂窩狀介孔二氧化硅納米粒子為載體，利用基因槍方法將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中，并在細(xì)胞中適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和地點(diǎn)釋放，成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株。利用電擊法直接在植物細(xì)胞壁上穿孔，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子負(fù)載DNA 導(dǎo)入水稻懸浮細(xì)胞，該方法既保護(hù)了DNA分子免受電擊、酶解的破壞，又提高了植物細(xì)胞的存活率［56］。Zhao 等［25］利用Fe3O4磁性納米顆粒的超順磁性，在磁場(chǎng)的定向驅(qū)動(dòng)作用下，納米載體復(fù)合物通過(guò)花粉孔將外源BtΔα·Cpti基因轉(zhuǎn)入棉花花粉，而花粉生活力沒(méi)有改變，并通過(guò)雜交授粉獲得轉(zhuǎn)基因棉花。以多聚賴氨酸修飾的淀粉納米粒子作為基因載體，將外源基因通過(guò)超聲波介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入盾葉薯蕷細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因的遺傳轉(zhuǎn)化［57］。

3.2 直接轉(zhuǎn)化方法

研究表明納米載體攜帶外源基因也可直接轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。其中以碳原子構(gòu)成的單壁碳納米管、多壁碳納米管、碳納米點(diǎn)等作為納米載體已經(jīng)成為實(shí)現(xiàn)完整植株遺傳轉(zhuǎn)化的熱門材料，轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化效率高，但多以瞬時(shí)轉(zhuǎn)化為主。例如，利用殼聚糖修飾的單壁碳納米管（CSCOV-SWNT）為載體，以葉片注射的方式將外源基因轉(zhuǎn)入煙草、芥菜等植物葉綠體質(zhì)體基因組［49］。siRNA 可以通過(guò)單壁碳納米管載體有效地轉(zhuǎn)化到煙草葉子，沉默外源基因的效率達(dá)95%，并且研究發(fā)現(xiàn)基因沉默效率取決于納米基因載體復(fù)合物顆粒的大小，性狀、緊實(shí)度及siRNA 負(fù)載的位點(diǎn)［58］。美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校通過(guò)制備聚乙烯亞胺功能化的單壁碳納米管（SWNTPEI），通過(guò)葉片直接浸染可以瞬時(shí)轉(zhuǎn)化完整煙草植株，從單壁碳納米管功能修飾到轉(zhuǎn)基因表達(dá)只需5 d［37，59］。英國(guó)布里斯托大學(xué)的Whitney 團(tuán)隊(duì)利用合成的碳納米點(diǎn)材料（Carbon dots，CD）包被含有Cas9 和gRNA 的質(zhì)粒，通過(guò)直接噴灑葉片實(shí)現(xiàn)了SPO11基因的編輯［60］。此外，多層雙金屬氧化物也是近年來(lái)發(fā)展的直接植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要載體［34］。Bao 等［55］用LDHs 負(fù)載熒光分子、小片段雙鏈DNA，通過(guò)浸染方式成功轉(zhuǎn)入擬南芥根表皮、葉肉表皮細(xì)胞及煙草懸浮細(xì)胞。Mitter 等［61］利用LDHs納米材料負(fù)載植物抗病毒干擾RNA，通過(guò)葉面噴灑實(shí)現(xiàn)了在植物葉面的長(zhǎng)效遞送。

4 納米載體介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

傳統(tǒng)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法主要為農(nóng)桿菌侵染法、基因槍法和病毒載體介導(dǎo)法。自1983 年獲得第1 例以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因煙草以來(lái)，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅猛發(fā)展，目前已經(jīng)有百余種轉(zhuǎn)基因植株問(wèn)世，其中80%是以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植株。但由于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過(guò)程中受到基因型和宿主范圍限制、組培再生以及轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞不一致等問(wèn)題，使許多植物，尤其是多年生林木樹(shù)種的遺傳轉(zhuǎn)化受到限制［77］。基因槍轉(zhuǎn)化法雖然不受植物物種限制，但需要昂貴的專用設(shè)備，而且高轟擊壓力易造成組織損壞［78］，需要提供一定量的外源基因才達(dá)到預(yù)期的轉(zhuǎn)基因效率，研究報(bào)道以SWNT 作為載體介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化所用pDNA 只有20 ng，而基因槍轉(zhuǎn)化則需要5 μg［79］。病毒載體介導(dǎo)法雖轉(zhuǎn)染效率高、應(yīng)用范圍廣，但更適宜于基因敲除、基因沉默等反向遺傳學(xué)研究，屬于瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，受宿主載體的局限性明顯［80］。

納米載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，是一項(xiàng)納米技術(shù)與生物技術(shù)交叉融合的新型轉(zhuǎn)化技術(shù)［17，81］。納米載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)：（1）納米載體體積小，大比表面積，易于化學(xué)基團(tuán)的功能修飾，可以高效負(fù)載外源基因，提高轉(zhuǎn)化效率；（2）納米粒子的結(jié)構(gòu)特性能夠保護(hù)負(fù)載基因免受DNase Ⅰ酶解，保證外源基因在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化；（3）納米載體利用納米粒子小體積效應(yīng)、可調(diào)節(jié)的物理和化學(xué)特性使其通過(guò)植物細(xì)胞壁的屏障進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，基本不受植物基因型和宿主范圍限制；（4）納米載體介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化所需時(shí)間短，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)影響；（5）納米材料種類多樣，粒徑大小和結(jié)構(gòu)類型易于變化、易于不同功能基團(tuán)和熒光標(biāo)記修飾，可形成多種不同類型的納米載體用于植物遺傳轉(zhuǎn)化。

5 納米粒子介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化面對(duì)的問(wèn)題和應(yīng)用前景

5.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化與穩(wěn)定表達(dá)

盡管目前報(bào)道的以納米載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)外源基因在葉片或葉肉細(xì)胞等部位的表達(dá)，但研究多以GFP、GUS 或RNAi片段為外源基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化為主，如何將納米載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因進(jìn)一步應(yīng)用于植物，獲得轉(zhuǎn)基因植株，需要進(jìn)一步擴(kuò)大目的基因，優(yōu)化轉(zhuǎn)化方法、擴(kuò)大轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞或組織的篩選，從而實(shí)現(xiàn)功能基因高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株，建立納米載體介導(dǎo)的簡(jiǎn)單、快捷、高效穩(wěn)定的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。

5.2 納米載體介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)

鋅指核酸酶（Zinc fingernucleases）和CRISPRassociated protein 9（Cas9）目前已經(jīng)成為重要的基因編輯工具，尤其是CRISPR-Cas9 已經(jīng)在水稻、番茄、高粱、小麥和棉花成功實(shí)現(xiàn)性狀改變［82］。CRISPRCas9 基因編輯的全方位和易操作性使其成為研究植物基因型-表現(xiàn)型對(duì)應(yīng)關(guān)系的重要工具。然而CRISPR-Cas9 基因編輯也面臨著遺傳轉(zhuǎn)化中植物細(xì)胞壁屏障轉(zhuǎn)化受體的限制［83］，盡管有少量研究報(bào)道可以通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體和體胚［84-85］。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)碳納米點(diǎn)載體介導(dǎo)的植物體內(nèi)的瞬時(shí)基因編輯，為納米載體與基因組編輯工具結(jié)合起來(lái)提供一個(gè)良好的機(jī)會(huì)［37］。今后應(yīng)利用納米載體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)基因的瞬時(shí)沉默或增強(qiáng)基因表達(dá)，進(jìn)一步開(kāi)展植物發(fā)育研究與重要基因功能鑒定；另一方面應(yīng)探索納米載體介導(dǎo)的穩(wěn)定、靶向性的基因編輯技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)植物品種改良。

5.3 納米載體介導(dǎo)的植物原位轉(zhuǎn)基因方法的探索

植物原位轉(zhuǎn)化方法是一種不需要植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)手段，而使植物在活體（in vivo）而非離體（in vitro）狀態(tài)下的轉(zhuǎn)化，能夠避免植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生的無(wú)性系變異和部分植株基因型難于進(jìn)行組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)［86］。納米粒子具有大比表面積、體積小、穿透性強(qiáng)的特性，通過(guò)注射、噴施及浸染等方式已實(shí)現(xiàn)了外源基因在完整植株葉片的轉(zhuǎn)染，如何利用納米粒子特性，進(jìn)一步發(fā)展納米載體介導(dǎo)的植物原位轉(zhuǎn)基因技術(shù)，一方面發(fā)展不依賴組培再生的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，突破頑拗型植物基因型或種類的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)難題；另一方面以納米載體介導(dǎo)不同株齡植株的遺傳轉(zhuǎn)化，根據(jù)時(shí)空需要進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究可能將是林業(yè)發(fā)展的又一種重要方向。