吳蓉 曹佳睿 曹君 劉飛翔 楊猛 蘇二正，2

（1. 南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，南京 210037；2. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京林業(yè)大學(xué)林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037）

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一類作用于三?；视偷孽ユI，將其水解成脂肪酸、二?；视?、單?；视秃透视偷纳锎呋瘎?］。脂肪酶廣泛存在于自然界各種動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，是一種重要的酯鍵水解酶，具有高度的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，在非水相體系也具有高效的催化活性［2］。南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarcticalipase B，CALB）作為一種性能優(yōu)異的脂肪酶，它既可以高效催化水溶性底物，也可以催化非水溶性底物［3］。因而，在生物柴油生產(chǎn)［4-7］、有機(jī)合成［8-10］、醫(yī)藥中間體合成［11-12］、手性化合物拆分［13］、木質(zhì)素增值化利用［14］和氨解反應(yīng)［15］等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

CALB 來源于在南極大陸被分離得到的南極假絲酵母，原始菌株酶產(chǎn)量低，發(fā)酵周期長(zhǎng)，而且分離成本高，難以滿足應(yīng)用需求［16］，所以目前基因工程技術(shù)法是生產(chǎn)CALB 的主要方法，通過構(gòu)建異源表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)CALB 的高效生產(chǎn)，將CALB 分別在大腸桿菌［17-22］、畢赤酵母［23-25］、釀酒酵母［26］和米曲霉［27］等宿主中進(jìn)行表達(dá)。由于其具有遺傳背景清楚，重組技術(shù)成熟，所用培養(yǎng)基簡(jiǎn)單廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)［28-29］，大腸桿菌是基因工程中最常用的宿主菌。Liu 等［18］首次在大腸桿菌Origami B 中進(jìn)行了CALB的功能性表達(dá)，隨后添加不同信號(hào)肽［30-31］、使用不同宿主菌［17］、密碼子優(yōu)化［19］和融合標(biāo)記［32］等方法被廣泛應(yīng)用于提高大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中CALB 的可溶性表達(dá)。但是，目前大腸桿菌異源表達(dá)CALB還存在一些問題，蛋白質(zhì)翻譯后無法被正確修飾，真核來源基因容易形成大量的包涵體［27］，導(dǎo)致了較低的表達(dá)量。發(fā)酵優(yōu)化是減少原核系統(tǒng)包涵體形成，提高蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)最直接有效的方法之一，同時(shí)還可以降低生產(chǎn)成本［33］，對(duì)于大腸桿菌表達(dá)CALB 的發(fā)酵優(yōu)化研究較少。因此，建立CALB 的大腸桿菌異源表達(dá)系統(tǒng)并探索最佳發(fā)酵工藝條件具有重要的意義。

本研究構(gòu)建了帶有不同信號(hào)肽的CALB基因重組質(zhì)粒，并導(dǎo)入到不同的大腸桿菌宿主菌中，成功實(shí)現(xiàn)了CALB 在大腸桿菌中的異源表達(dá)。然后，以重組菌為研究對(duì)象，通過對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、誘導(dǎo)條件、培養(yǎng)基成分等的系統(tǒng)優(yōu)化，期望實(shí)現(xiàn)CALB在大腸桿菌中高水平可溶性表達(dá)，為CALB 的低成本、高酶活重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 表達(dá)質(zhì)粒pET-25b 和表達(dá)宿主E.coliBL21（DE3）和E.coliRosetta（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室自主保藏。CALB基因片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.2 主要試劑 PCR 擴(kuò)增試劑盒（PrimeSTAR?HS DNA Polym）、限制性內(nèi)切酶（NcoI、NdeI、EcoRI）和T4 連接試劑盒（T4 DNA Ligase）等均由大連TaKaRa 生物公司提供，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）和氯霉素（Chloramphenicol，Cml）由上海生工生物公司提供，5×考馬斯亮藍(lán)G-250 試劑盒和牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA）由北京索萊寶公司提供，胰蛋白胨和酵母提取物由Oxoid 公司提供。對(duì)硝基苯酚（pNP）和對(duì)硝基苯酚乙酸酯（pNPA）由上海源葉生物科技有限公司提供。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L（固體平板加入瓊脂粉20 g/L）；Super Broth（SB）培養(yǎng)基：蛋白胨30 g/L，酵母提取物15 g/L，NaCl 15 g/L；Terrific Broth（TB）培養(yǎng)基：蛋白胨12 g/L，酵母提取物24 g/L，甘油5 g/L，K2HPO472 mmol/L，KH2PO417 mmol/L；YTGN broth（TY）培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物 10 g/L，甘油 8 g/L，Na2HPO45 g/L。用于培養(yǎng)大腸桿菌E.coliBL21（DE3）的培養(yǎng)基中添加終濃度為100 μg/mL 的氨芐青霉素，用于培養(yǎng)大腸桿菌E.coliRosetta（DE3）的培養(yǎng)基中添加終濃度各為100 μg/mL 的氨芐青霉素和氯霉素。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)南極假絲酵母脂肪酶B 基因序列（GenBank 登錄號(hào)為 Z30645.1）設(shè)計(jì)如下引物。P1：5'-CATGCCATGGATGATGATGATGATCTACCTT CCGGTTCGGACCCT-3'，P2：5'-GGAATTCAGGGGGT GACGATGCCGGAGCA-3'；P3：5'-GTCCATATGAAAA AGATTTGGCTGGCGCTGGCGGGCCTGGTGCTGGCGT TTAGCGCGAGCGCCATGGATGATGATGATG-3'，P4：5'-GGAATTCAGGGGGTGACGATGCCGGAGCAGGTC CTTT-3'。在P1、P2 兩條引物的5'端分別引入NcoI和EcoRI 限制性酶切位點(diǎn)（劃線部分），在P3、P4兩條引物的5'端分別引入NdeI 和EcoRI 限制性酶切位點(diǎn)（劃線部分）并添加保護(hù)堿基。為了促進(jìn)CALB的可溶性表達(dá)，在原始基因序列的上游添加了5 個(gè)天冬氨酸融合標(biāo)簽［20］。引物由金斯瑞（南京）公司合成。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以CALB基因作為擴(kuò)增模板，以P1 和P2 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得重組質(zhì)粒pET25b-CALB-1，以P3 和P4 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得重組質(zhì)粒pET25b-CALB-2（94℃變性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸1 min，工作30 個(gè)循環(huán)）。PCR 產(chǎn)物與表達(dá)質(zhì)粒pET25b 使用NcoI/EcoRI 內(nèi)切酶和NdeI/EcoRI 內(nèi)切酶進(jìn)行過夜酶切，膠回收后用T4 連接酶將目的基因和線性化載體連接，再使用氯化鈣轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行感受態(tài)轉(zhuǎn)化。篩選陽性重組子，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR 和雙酶切驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast 比對(duì)分析，若未發(fā)生突變，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.2.3 重組工程菌的篩選和表達(dá) 構(gòu)建好的重組質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21（DE3）和E.coliRosetta（DE3）中，然后在添加相應(yīng)抗生素的LB 瓊脂平板上37℃培養(yǎng)過夜。分別挑取重組菌pET25b-CALB-1/ BL21（DE3）、pET25b-CALB-1/Rosetta（DE3）、pET25b-CALB-2/ BL21（DE3）和pET25b-CALB-2/Rosetta（DE3）4 種單菌落，接種到10 mL LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，再按1%接種量接種到50 mL 的LB 培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min 培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8 時(shí)添加終濃度為0.2 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體和發(fā)酵液。將菌體用Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）復(fù)溶后，進(jìn)行超聲破碎（功率300 W，超聲3 s，間隔5 s，工作時(shí)間10 min），并離心收集菌體上清液和菌體沉淀，用于酶活力測(cè)定、蛋白濃度測(cè)定和SDS-PAGE 分析。

1.2.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選、誘導(dǎo)條件和培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

1.2.4.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選 將方法1.2.3 篩選出的重組菌在LB、TB、SB 和TY 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)發(fā)酵，比較不同培養(yǎng)基對(duì)CALB在大腸桿菌中表達(dá)的影響。

1.2.4.2 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 研究不同濃度的IPTG 和乳糖作為誘導(dǎo)劑，在不同誘導(dǎo)溫度下誘導(dǎo)CALB的表達(dá)情況。

1.2.4.3 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化 為了進(jìn)一步提高CALB表達(dá)量的同時(shí)降低培養(yǎng)基的成本，分別用不同種類和濃度的碳源和氮源替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的原始碳源和氮源，用不同濃度的安琪酵母替代Oxoid 酵母提取物，并對(duì)無機(jī)鹽的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。

1.2.5 進(jìn)程曲線 將重組菌接種到方法1.2.4 篩選出的最優(yōu)成分的培養(yǎng)基中，在最優(yōu)的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)72 h，每隔6 h 取一次樣，研究重組菌經(jīng)過不同時(shí)間誘導(dǎo)后的生長(zhǎng)情況和CALB的表達(dá)量。

1.2.6 分析方法

1.2.6.1 CALB 酶活力的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［17］所述并做了部分修改，通過測(cè)定pNPA 的初始水解速率，測(cè)定CALB 的活性。取10 μL 含有200 mmol/LpNPA的乙腈溶液，加入435 μL 乙腈溶液和5.5 mL Tris-HCl 緩沖液（0.05 mmol/L，pH 8.0），最后加入粗酶液10 μL，25℃反應(yīng)5 min，測(cè)定反應(yīng)液在404 nm 處的吸光值。一個(gè)酶活力單位（U）定義為在25℃，pH 8.0 的條件下，1 min 內(nèi)催化生成1 μmolpNP 所需要的酶量，酶活力（U/mL）定義為每毫升發(fā)酵菌液具有的酶活力單位數(shù)，即單位體積重組菌胞內(nèi)和胞外產(chǎn)生酶活的總和。

1.2.6.2 SDS-PAGE 分析 取方法1.2.3 中的發(fā)酵液、菌體上清液和菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 分析。采用12%的分離膠和5%的濃縮膠制膠，電泳后使用考馬斯亮藍(lán)R-250 進(jìn)行染色。

1.2.6.3 蛋白濃度的測(cè)定 根據(jù)Bradford 測(cè)定法［34］原理進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，按照蛋白定量試劑盒（5×考馬斯亮藍(lán)G-250），根據(jù)測(cè)定的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 為：y=2.580 3x+0.003 7（0＜x＜0.16）R2=0.996 7，在0-0.16 mg/mL 濃度范圍內(nèi)的線性較強(qiáng)，該方程可以用于蛋白的定量分析。CALB 的比活力定義為在25℃，pH 8.0 的條件下，單位重量（mg）蛋白所具有的CALB 酶活力單位數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

按1.2.2 方法構(gòu)建帶有自身PelB 信號(hào)肽（圖1-A）和DsbA 信號(hào)肽（圖1-B）的重組質(zhì)粒，構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別經(jīng)過NcoI/EcoRI 和NdeI/EcoRI 雙酶切驗(yàn)證（圖1-C），均在1 000 bp 和5 500 bp 左右形成了兩個(gè)條帶，下方條帶與插入目的基因大小相同，上方條帶與載體片段大小相同，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast 比對(duì)分析，均未發(fā)生突變，表明帶有自身PelB 信號(hào)肽和DsbA 信號(hào)肽的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，分別命名為pET25b-CALB-1 和pET25b-CALB-2。

2.2 重組工程菌的表達(dá)和篩選4種重組菌

pET25b-CALB-1/ BL21（DE3）、pET25b-CALB-1/Rosetta（DE3）、pET25b-CALB-2/ BL21（DE3） 和pET25b-CALB-2/Rosetta（DE3）接種到TB 培養(yǎng)基后在25℃下經(jīng)過0.2 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)48 h 后，表達(dá)的CALB 酶活力分別達(dá)到1.52、1.90、1.23 和1.58 U/mL，而相同條件下空宿主表達(dá)產(chǎn)物沒有酶活力。從酶活力測(cè)定結(jié)果來看，帶有自身PelB 信號(hào)肽的重組菌表達(dá)量明顯高于帶有DsbA 信號(hào)肽的重組菌，宿 主 菌E.coliRosetta（DE3）比E.coliBL21（DE3）更適合用于CALB 的異源表達(dá)。從SDS-PAGE 電泳結(jié)果來看，4 種重組菌發(fā)酵后的上清液（圖2-A）、菌體上清液（圖2-B）和菌體沉淀（圖2-C）在33 kD 左右有明顯條帶，且?guī)в凶陨鞵elB 信號(hào)肽的兩種重組菌條帶更為明顯，而空宿主除本身的特征條帶外沒有該條帶，表明4 種重組菌都可以成功表達(dá)CALB，帶有自身PelB 信號(hào)肽的重組菌表達(dá)效果更好。所以，選擇CALB 酶活力最高的重組菌pET25b-CALB-1/Rosetta（DE3）進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵優(yōu)化。

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和雙酶切驗(yàn)證

2.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的優(yōu)化

選用SB、TB、LB 和TY 四種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，重組 菌pET25b-CALB-1/Rosetta（DE3） 在25℃下 經(jīng)過0.2 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)48 h 和60 h 后的表達(dá)和生長(zhǎng)情況，如圖3 所示。在CALB 的可溶性表達(dá)方面，4 種培養(yǎng)基中以TB 和TY 培養(yǎng)基效果最好，SB培養(yǎng)基次之，LB 培養(yǎng)基效果最差，說明不同培養(yǎng)基對(duì)CALB 的表達(dá)效果具有不同的影響；對(duì)于SB、TB和LB 三種培養(yǎng)基來說，誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)沒有明顯提高CALB的可溶性表達(dá)，而使用TY 培養(yǎng)基表達(dá)的CALB酶活力和比活力均有了顯著的提高，且酶活力達(dá)到了最高值2.37 U/mL。在菌體生長(zhǎng)方面，在TB和TY 培養(yǎng)基中獲得的細(xì)胞密度明顯高于SB 和LB，當(dāng)重組菌在TB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 h 時(shí)OD600達(dá)到最高值，說明TB 和TY 培養(yǎng)基更有助于大腸桿菌的生長(zhǎng)。因此，選擇誘導(dǎo)60 h 后可溶性表達(dá)效果最好的TY培養(yǎng)基作為下一步優(yōu)化的基本培養(yǎng)基。

圖2 重組菌的SDS-PAGE 分析圖

2.4 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.4.1 誘導(dǎo)劑種類和濃度的優(yōu)化 重組菌在25℃條件下經(jīng)過不同濃度的IPTG（0.05-1 mmol/L）和乳糖（0.5%-3%）誘導(dǎo)60 h 后研究CALB的可溶性表達(dá)和生長(zhǎng)情況。如圖4-A 所示，隨著IPTG 濃度的升高，菌體生長(zhǎng)和CALB 的可溶性表達(dá)均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，酶活力在IPTG 濃度為0.1 mmol/L 時(shí)達(dá)到最高，為2.19 U/mL。如圖4-B 所示，加入不同濃度的乳糖誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞密度沒有顯著的影響，但明顯低于IPTG 誘導(dǎo)的重組菌細(xì)胞密度；當(dāng)乳糖濃度低于1%時(shí)，CALB 的可溶性表達(dá)效果最好，乳糖濃度高于1%后，CALB 的酶活力逐漸下降，比活力保持穩(wěn)定。當(dāng)乳糖濃度為0.5%時(shí)，比活力最高，酶活力為2.79 U/mL，與0.75%和1%乳糖濃度下的酶活力沒有顯著性差異，與用0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)相比，提高了約0.27 倍。因此，濃度為0.5%的乳糖溶液是誘導(dǎo)大腸桿菌中CALB 表達(dá)的最佳誘導(dǎo)劑。

2.4.2 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 加入乳糖誘導(dǎo)劑后分別在16、20、25、30 和37℃下誘導(dǎo)60 h，結(jié)果如圖5 所示。隨著溫度的升高，CALB 的酶活力和比活力均呈現(xiàn)出升高后降低的趨勢(shì)，在誘導(dǎo)溫度為20℃時(shí)，酶活力達(dá)到最高為8.31 U/mL；而細(xì)胞密度OD600表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，25℃時(shí)細(xì)胞密度OD600最低。高溫和低溫對(duì)于CALB 的表達(dá)都有不利的影響，但總體來說，高溫有利于大腸桿菌的生長(zhǎng)卻更加不利于酶的可溶性表達(dá)，表現(xiàn)出更低的酶活力。因此，選擇20℃作為最適于重組菌生長(zhǎng)和表達(dá)的誘導(dǎo)溫度。

圖3 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)CALB 可溶性表達(dá)的影響

2.5 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.5.1 碳源種類和濃度的優(yōu)化 選擇了1%（W/V）的6 種碳源（蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、淀粉和糊精）代替TY 培養(yǎng)基中的0.8%（W/V）甘油，結(jié)果如表1 所示。蔗糖、葡萄糖和淀粉導(dǎo)致了較低的酶活力、比活力和細(xì)胞密度，其中葡萄糖是最不利于CALB 表達(dá)的碳源；而甘油、山梨醇和糊精有利于CALB 的表達(dá)，促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)，且產(chǎn)生了較高的酶活力和比活力。山梨醇是對(duì)重組菌生長(zhǎng)和表達(dá)CALB 效果最佳的碳源，誘導(dǎo)60 h 后，CALB 酶活力最高達(dá)到了12.12 U/mL，相比于甘油作為碳源，酶活力提高了1.04 倍，所以選擇山梨醇作為發(fā)酵培養(yǎng)的碳源。為了獲得更高的酶活力，進(jìn)一步優(yōu)化了加入山梨醇的濃度（0.75%-2.5%，W/V），結(jié)果如圖6 所示。隨著山梨醇濃度的提高，細(xì)胞密度OD600值呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢(shì)，CALB 的酶活力和比活力則逐步提高。當(dāng)山梨醇濃度達(dá)到1.75%（W/V）后，酶活力和比活力最高，酶活力為18.86 U/mL，然后開始下降。因此，選擇1.75%（W/V）糊精代替0.8%（W/V）甘油作為下一步優(yōu)化的最佳碳源。

圖4 不同濃度的IPTG（A）和乳糖（B）對(duì)CALB 表達(dá)的影響

圖5 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)CALB 表達(dá)的影響

表1 不同碳源對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)和CALB 表達(dá)的影響

圖6 不同濃度的糊精對(duì)CALB 表達(dá)的影響

2.5.2 氮源種類和濃度的優(yōu)化 選擇了2%（W/V）的6 種碳源，豆粕（Soybean meal，SM）、牛骨蛋白胨（Bovine bone peptone，BBP）、 魚蛋白胨（Fish peptone，F(xiàn)P）、花生粉（Peanut powder，PP）和玉米漿（Corn steep liquor，CSL）代替TY 培養(yǎng)基中的Oxoid 胰蛋白胨，結(jié)果如表2 所示。使用SM、PP 和CSL 替代胰蛋白胨作為氮源后，CALB 的表達(dá)量明顯下降了；而BBP 和FP 作為替代氮源對(duì)于CALB 的可溶性表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用。其中，F(xiàn)P 是最適合用于重組菌生長(zhǎng)和表達(dá)CALB 的氮源，CALB 酶活力達(dá)到22.70 U/mL。進(jìn)一步研究了FP 濃度（1%-2.5%，W/V）對(duì)于CALB表達(dá)的影響，結(jié)果如圖7 所示。當(dāng)FP 濃度較低時(shí)，重組菌生長(zhǎng)緩慢且CALB 的可溶性表達(dá)水平較低，隨著FP 濃度升高，細(xì)胞密度OD600和CALB 的酶活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，比活力則逐步提高后保持穩(wěn)定，當(dāng)FP 濃度為2.25%（W/V）時(shí)，CALB 的酶活力最高，為23.90 U/mL，相比于2%（W/V）胰蛋白胨作為氮源，酶活力提高了0.23 倍。因此，選擇2.25%（W/V）魚蛋白胨代替2%（W/V）胰蛋白胨作為下一步優(yōu)化的最佳氮源。

表2 不同氮源對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)和CALB 表達(dá)的影響

圖7 不同濃度的魚蛋白胨對(duì)CALB 表達(dá)的影響

2.5.3 安琪酵母替代物的優(yōu)化 選擇價(jià)格低廉的國(guó)產(chǎn)安琪酵母提取物替換TY 培養(yǎng)基的Oxoid 酵母提取物，并進(jìn)一步優(yōu)化安琪酵母提取物的濃度（0.5%-4%，W/V）以達(dá)到降低培養(yǎng)基的成本并保持CALB表達(dá)量的目的。如圖8 所示，當(dāng)國(guó)產(chǎn)安琪酵母提取物濃度為1%（W/V）時(shí)，CALB 的酶活力和比活力均達(dá)到最高值，酶活力為27.43 U/mL，相比于Oxoid 酵母提取物略有提高。因此，國(guó)產(chǎn)安琪酵母提取物的最佳濃度為1%（W/V）。

圖8 不同濃度的安琪酵母提取物對(duì)CALB 表達(dá)的影響

2.5.4 無機(jī)鹽濃度的優(yōu)化 原TY 培養(yǎng)基中無機(jī)鹽為0.5%（W/V）Na2HPO4，通過調(diào)節(jié)濃度（0.25%-1.25%，W/V）以獲得更高的CALB 酶活力，結(jié)果如圖9 所示。當(dāng)無機(jī)鹽Na2HPO4濃度為0.75%（W/V）時(shí)，CALB 的酶活力最高為36.43 U/mL，同時(shí)伴隨著較高的細(xì)胞密度OD600和比活力，經(jīng)過無機(jī)鹽濃度優(yōu)化后酶活力提高了0.26 倍。因此，選擇0.75%（W/V）Na2HPO4作為培養(yǎng)基中最佳濃度的無機(jī)鹽。

圖9 不同濃度的Na2HPO4 對(duì)CALB 表達(dá)的影響

2.6 進(jìn)程曲線

經(jīng)過一系列優(yōu)化后，在含有1.75%（W/V）山梨醇、2.25%（W/V）魚蛋白胨、1%（W/V）安琪酵母提取物、0.75%（W/V）Na2HPO4的最優(yōu)培養(yǎng)基中，加入0.5%（W/V）乳糖作為誘導(dǎo)劑，研究了pET25b-CALB-1/Rosetta（DE3）在搖瓶中的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)程，結(jié)果如圖10 所示。在發(fā)酵前期，重組菌呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，48 h 后細(xì)胞密度OD600趨于穩(wěn)定，直至60 h 菌體開始步入衰亡期。CALB酶活力和比活力的變化趨勢(shì)基本保持一致，60 h 時(shí)達(dá)到最高值，然后開始下降。因此，最佳的發(fā)酵時(shí)間為60 h，此時(shí)CALB 酶活力最高為35.67 U/mL，比活力為19.18 U/mg，細(xì)胞密度OD600為17.65。

圖10 最優(yōu)條件下的發(fā)酵進(jìn)程曲線

3 討論

CALB 來源于真核生物南極假絲酵母，在大腸桿菌中的重組表達(dá)已有一些研究，然而，最終獲得的酶活卻不足以滿足應(yīng)用需求。Ujiie 等［19］利用E.coliBL21（DE3）作為表達(dá)CALB 的宿主菌，優(yōu)化搖瓶誘導(dǎo)條件后CALB 的總酶活約為13 U/mL。Zhou等［32］為提高大腸桿菌中CALB 的可溶性表達(dá)，引入多氨基酸標(biāo)記，成功表達(dá)了6His-CalB-10Lys，最終比活力為10.1 U/mL。Kim 等［20］構(gòu)建了基于PelB信號(hào)肽連接5 個(gè)天冬氨酸標(biāo)簽的CALB 表達(dá)系統(tǒng)P-D5-CALB，并在E. coliBL21 star（DE3）中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果表明重組菌胞外和胞內(nèi)比活力分別為2.2 和0.3 U/mg，相對(duì)于沒有添加5 個(gè)天冬氨酸標(biāo)簽的P-CalB分別提高了8.4 倍和3 倍。基于以上現(xiàn)狀，本研究將添加了5 個(gè)天冬氨酸標(biāo)簽的CALB基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)建了帶有不同信號(hào)肽和不同宿主菌的4 種重組菌，在搖瓶中進(jìn)行初步發(fā)酵對(duì)比，篩選出最佳重組菌后進(jìn)行培養(yǎng)基種類、誘導(dǎo)條件、培養(yǎng)基成分等的優(yōu)化。

首先，通過重組菌的構(gòu)建和表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，帶有PelB 信號(hào)肽并在E. coliRosetta（DE3）中進(jìn)行表達(dá)的重組菌pET25b-CALB-1/Rosetta（DE3）在CALB的表達(dá)上具有明顯的優(yōu)勢(shì)，搖瓶初步發(fā)酵酶活力達(dá)到了1.90 U/mL。這一研究結(jié)果和Kim 等［20］構(gòu)建的P-D5-CalB系統(tǒng)存在一定異同，說明了PelB 信號(hào)肽序列的結(jié)合促進(jìn)了胞內(nèi)和胞外CALB 的表達(dá)，且不同的信號(hào)肽影響CALB 表達(dá)的效果不同。PelB 信號(hào)肽可以將目的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間，有利于目的蛋白的正確折疊，并維持構(gòu)象［35］。添加DsbA 序列可以在蛋白質(zhì)折疊過程中將肽鏈上的巰基氧化成二硫鍵［36-37］，對(duì)目的蛋白的活性和穩(wěn)定性具有重要作用。信號(hào)肽PelB 和DsbA 同樣具有促進(jìn)CALB 蛋白質(zhì)正確折疊的作用，但是帶有信號(hào)肽PelB 重組菌的酶表達(dá)量卻明顯優(yōu)于DsbA。一方面，PelB 將目的蛋白表達(dá)定位在周質(zhì)空間，周質(zhì)空間具有氧化性，更有利于目的蛋白維持空間構(gòu)象，而帶有DsbA 信號(hào)肽的重組菌在胞內(nèi)表達(dá)CALB，更容易受胞內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的影響，不利于維持蛋白的穩(wěn)定性。另一方面，DsbA 并不是pET25b 的天然信號(hào)肽，可能會(huì)影響目的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致較低的CALB 表達(dá)水平。因此，宿主菌E. coliRosetta（DE3）比E. coliBL21（DE3）更適合于CALB 的表達(dá)。

其次，適宜的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)條件是獲得過量重組蛋白的必要條件［38］?；A(chǔ)培養(yǎng)基的篩選研究結(jié)果表明，培養(yǎng)60 h 時(shí)TY 培養(yǎng)基效果最好，但細(xì)胞密度并不是最高的，說明菌體生長(zhǎng)越好并不一定代表蛋白表達(dá)量越高。營(yíng)養(yǎng)成分單一的LB 和SB 培養(yǎng)基效果明顯不如營(yíng)養(yǎng)成分豐富的TY 和TB 培養(yǎng)基，因?yàn)楦缓瑺I(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基可能更有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和重組菌的酶表達(dá)［39］。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，僅TY 培養(yǎng)基產(chǎn)生的CALB 酶活明顯提高，說明使用TY 培養(yǎng)基具有獲得更高表達(dá)量的潛力。在優(yōu)化誘導(dǎo)劑的種類和濃度的研究中發(fā)現(xiàn)，相比于IPTG 作為誘導(dǎo)劑，在乳糖的誘導(dǎo)作用下重組菌的細(xì)胞密度更低，可能是因?yàn)槿樘且彩且环N碳源，糖類作為碳源不利于重組菌pET25b-CALB-1/Rosetta（DE3）的生長(zhǎng)，這一點(diǎn)在本試驗(yàn)碳源種類和濃度的優(yōu)化中得到了驗(yàn)證，蔗糖和葡萄糖的加入也導(dǎo)致了較低的細(xì)胞密度。在進(jìn)行誘導(dǎo)溫度的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫誘導(dǎo)更加有利于CALB 的可溶性表達(dá)，一方面可能是因?yàn)楦邷貙?duì)菌體生長(zhǎng)有益，重組蛋白來不及正確折疊，容易以包涵體的形式出現(xiàn)［40］；另一方面，由于CALB 來源于南極大陸分離得到的南極假絲酵母，耐低溫性強(qiáng)［41］，所以低溫條件下CALB 的表達(dá)量更高。

最后，探究了培養(yǎng)基成分對(duì)產(chǎn)量的影響，進(jìn)行碳源、氮源、酵母提取物和無機(jī)鹽的優(yōu)化，最終確定了有利于CALB 表達(dá)的最佳培養(yǎng)基。各成分濃度的提高均有利于CALB 表達(dá)量的積累，但濃度過高會(huì)影響重組菌的生長(zhǎng)和表達(dá)情況，原因可能是高濃度的培養(yǎng)基成分會(huì)影響重組菌生長(zhǎng)環(huán)境的碳氮比、pH 和滲透壓等關(guān)鍵因素，進(jìn)而對(duì)酶的表達(dá)量產(chǎn)生不利影響［42］。相比于原始TY 培養(yǎng)基，本研究?jī)?yōu)化的最佳培養(yǎng)基采用價(jià)格低廉的魚蛋白胨和國(guó)產(chǎn)安琪酵母提取物，降低了CALB 的生產(chǎn)成本。經(jīng)過發(fā)酵進(jìn)程曲線的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵60 h 后CALB 的酶活最高可達(dá)到35.67 U/mL。通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、誘導(dǎo)條件和培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，CALB 的酶活力提高了17.77 倍，是目前以大腸桿菌為宿主菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)CALB的最高水平。

本研究構(gòu)建了異源表達(dá)CALB 的重組菌，并分別對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、誘導(dǎo)條件、培養(yǎng)基成分和進(jìn)程曲線進(jìn)行了探究，既降低了生產(chǎn)成本又實(shí)現(xiàn)了CALB 的高效表達(dá)。但是，一部分胞內(nèi)的目的蛋白通過破碎菌體才能獲得，有關(guān)CALB 的胞外分泌還需進(jìn)一步加強(qiáng)研究。因此，在后續(xù)的研究工作中，我們將通過添加大腸桿菌胞外分泌的化學(xué)助劑、信號(hào)肽優(yōu)化、CALB編碼基因密碼子優(yōu)化、融合表達(dá)和共表達(dá)分子伴侶等方法提高CALB 的胞外分泌，并進(jìn)行發(fā)酵罐放大培養(yǎng)的研究，旨在進(jìn)一步提高CALB的胞外分泌效果并達(dá)到更高產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本研究成功實(shí)現(xiàn)了CALB 在大腸桿菌中的異源表達(dá)，探究了不同信號(hào)肽和不同宿主菌對(duì)表達(dá)量的影響，并對(duì)培養(yǎng)基種類和誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最佳組合是帶有PelB 信號(hào)肽的 pET25b-CALB-1/Rosetta（DE3）重組菌株在20℃下使用0.5%（W/V）乳糖在TY 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)TY 培養(yǎng)基的組成成分進(jìn)行了詳細(xì)優(yōu)化，優(yōu)化后的合成培養(yǎng)基成分為1.75%（W/V）山梨醇、2.25%（W/V）魚蛋白胨、1%（W/V）安琪酵母、0.75%（W/V）Na2HPO4。在搖瓶中誘導(dǎo)60 h 后，CALB 酶活力最高達(dá)到35.67 U/mL。