殷俊磊 張艷芳 鄒凡雨 潘鵬濤 段艷紅 仇書興

（新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003）

由雞白痢沙門菌（SalmonellaPullorum）引起的雞白?。≒ullorum disease）是一種全身系統(tǒng)性疾病，多侵害3 周齡以內(nèi)的雛雞，以白色黏稠樣下痢和急性敗血癥為主要臨床特征，發(fā)病率和死亡率極高，最高可達(dá)100%；對日齡較大的青年雞亦可致病和致死；受感染的成年雞一般不發(fā)病，但其生產(chǎn)性能會下降，受污染種蛋的孵化率和出雛率明顯降低，垂直傳播一直是制約該病凈化的關(guān)鍵因素之一［1］。目前，該病在很多國家（如中國、俄羅斯、巴西、英國、法國、孟加拉國、尼日利亞、阿根廷、印度等）仍有一定程度的發(fā)生和流行，嚴(yán)重制約著養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展，并給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失［2-3］。

目前，進行藥物控制和淘汰發(fā)病雞（群）是防控該病的常用策略，但藥物控制會引起耐藥性和藥物殘留等諸多問題，并且耐藥性可經(jīng)食物鏈傳播給人類；而淘汰發(fā)病雞（群）的方法嚴(yán)重受到社會發(fā)展水平的制約，控制成本較高，在很多國家實施起來有一定的困難［4-5］。疫苗接種是一個較好的預(yù)防沙門菌病的方法，如滅活疫苗、減毒疫苗、亞單位疫苗、重組疫苗等，但當(dāng)前尚沒有專門針對雞白痢沙門菌的商品化減毒活疫苗［6］。

SptP 蛋白具有酪氨酸磷酸酶活性，與沙門菌毒力密切相關(guān)，可經(jīng)沙門菌致病島1（SPI1）Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）分泌發(fā)揮作用，其分泌需要分子伴侶Scip 的協(xié)助，SptP 具有耐高溫和耐鹽性［7］。沙門菌感染宿主細(xì)胞初期，SptP 可抑制細(xì)胞膜皺褶的形成，參與宿主細(xì)胞骨架的重排，以利于沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活和增殖［8］。研究顯示，sptP基因的缺失會引起腸炎沙門菌的毒力顯著下降，并且該缺失株可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生顯著的免疫應(yīng)答反應(yīng)，為小鼠提供有效的免疫保護［9］，而在雞白痢沙門菌中尚未見到相關(guān)報道。這為基于sptP基因缺失研發(fā)雞白痢疫苗提供了思路。

因此，本研究擬利用基因工程方法構(gòu)建雞白痢沙門菌sptP基因的缺失突變株C79-13ΔsptP，并分析其生長、生化及毒力等基本生物學(xué)特性，然后評價該缺失株對3 日齡雛雞的口服免疫效果，以期為基于sptP基因雞白痢沙門菌減毒活疫苗的研發(fā)提供數(shù)據(jù)。

表1 PCR 擴增的引物序列

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及實驗動物 雞白痢沙門菌C79-13 購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；質(zhì)粒pkD46（氨芐青霉素抗性，Ampr）、pKD3（氯霉素抗性，Cmr）、pCP20（Ampr，Cmr）和pBR322-sptP（Ampr）等 均由本實驗室保存；實驗用海蘭白雛雞（沙門菌抗體陰性）由北京艾普希隆生物科技有限公司提供的雞胚自孵。復(fù)蘇細(xì)菌時挑單菌落在LB 液體培養(yǎng)基于37℃，180 r/min 條件下過夜培養(yǎng)。根據(jù)需要加入終濃度100 μg/mL 的氨芐青霉素（Amp）或34 μg/mL的氯霉素（Cm）。

1.1.2 主要試劑TaqDNA 聚合酶、高保真DNA 聚合酶和DNA 膠回收試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌微量生化發(fā)酵管購自杭州天和微生物試劑有限公司；L-阿拉伯糖與HRP 標(biāo)記的兔抗雞IgG 抗體購自Sigma 公司；TMB 顯色液購自碧云天生物技術(shù)研究所；淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI 1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco 公司；Amp 和Cm 購自生工生物工程有限公司。

1.1.3 引物 根據(jù)GenBank 中公布的雞白痢沙門菌sptP基因序列及相關(guān)參考文獻［9］，利用軟件Primer 5.0設(shè)計出特異性引物（表1）。F1/F2 為用于同源重組的引物對，每條引物分別由兩部分組成，其中5'端大寫部分序列與sptP基因為同源或互補序列，3'端小寫部分序列與質(zhì)粒pKD3 上的氯霉素序列為同源或互補序列；CX1/CX2 缺失株構(gòu)建后的PCR 驗證及測序引物；H1/H2 為互補株的驗證引物。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 雞白痢沙門菌sptP基因缺失株C79-13ΔsptP及其互補株C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）的構(gòu)建以pKD3 為模板，用引物F1/F2 進行PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，將其回收、純化用作打靶片段，電轉(zhuǎn)化到誘導(dǎo)表達(dá)了重組蛋白的C79-13/pKD46 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)Amp 和Cm 篩選pKD46 丟失的菌株C79-13ΔsptP∷Cm，電轉(zhuǎn)化pCP20 至感受態(tài)的C79-13ΔsptP∷Cm，利用溫度敏感性、抗性及PCR 和測序鑒定構(gòu)建雞白痢沙門菌sptP基因缺失株C79-13ΔsptP；然后將本實驗室保存的互補質(zhì)粒pBR322-sptP電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的C79-13ΔsptP，Amp 抗性平板篩選陽性克隆子，經(jīng)PCR 鑒定構(gòu)建互補株C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）［10］。

1.2.2 C79-13ΔsptP的生長和生化特性鑒定 分別挑 取 雞 白 痢 沙 門 菌C79-13、C79-13ΔsptP和C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）的單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，第2 天分別轉(zhuǎn)接至15 mL 的LB液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始OD600的值為0.05，37℃，200 r/min 搖振培養(yǎng)，連續(xù)14 h，每隔2 h 取樣和測定OD600值，并繪制細(xì)菌的生長曲線。同時，分別挑取這3 株菌的單菌落接種于葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、丙二酸鹽、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、尿素、L-阿拉伯糖和硫化氫等生化鑒定管，37℃過夜，觀察生化鑒定結(jié)果。

1.2.3 C79-13ΔsptP對雛雞的毒力試驗 分別以PBS洗滌在LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的C79-13、C79-13ΔsptP和C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）菌株3 次并懸浮，根據(jù)需要進行連續(xù)10 倍倍比稀釋，每個稀釋度給10 只2 日齡雛雞進行口服，另設(shè)置PBS 對照組，每只500 μL，分組情況及攻毒劑量見表2，連續(xù)觀察14 d 并統(tǒng)計死亡情況，根據(jù)Bliss 法計算各菌株的LD50，評價其毒力。

1.2.4 免疫對雛雞體重變化及臨床表現(xiàn)的影響 將60 只3 日齡雛雞隨機分為2 組，分別為免疫組（n=25）和對照組（n= 35），免疫組每只雛雞的口服接種劑量為100 μL 含1.0 × 108CFU 的C79-13ΔsptP，對照組每只雛雞僅口服接種100 μL PBS。在接種后的第5、12 和19 天分別測定免疫組和對照組雛雞的體重，同時觀察并記錄雛雞的臨床狀態(tài)。

1.2.5 血清IgG 水平的測定 分別于免疫后的第7、14 與21 天從每組雞群中隨機取5 只進行血液（抗凝）樣品的采集，分離部分血液樣品血清，淘汰采樣雞。取免疫后第7、14 與21 天采集的血液樣品分離血清，以1∶50 稀釋作為一抗，HRP 標(biāo)記的兔抗雞IgG 抗體（1∶10 000）作為二抗，以加熱滅活的雞白痢沙門菌C79-13 株P(guān)BS 懸液作為抗原進行包被，應(yīng)用間接ELISA 測定血清抗體在492 nm 的吸光值（OD492）來確定IgG 水平［11］。

1.2.6 外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗 取免疫后第7、14 與21 天采集的血液樣品，利用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色、計數(shù)，調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度至5.0 × 106個/mL，96 孔板每孔接種100 μL 完全培養(yǎng)基懸浮的淋巴細(xì)胞懸液，41℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h，用雞白痢沙門菌C79-13 制備可溶性抗原；然后用三磷酸腺苷發(fā)光法測量淋巴細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果用刺激指數(shù)（Stimulation index，SI）表示［11-12］。

1.2.7 攻毒試驗 于免疫后第10 天隨機從免疫組中取出10 只，命名為A 組；從對照組中取出20 只，分成B 組和C 組，每組10 只。用雞白痢沙門菌C79-13 株以2.0 × 109CFU/只的劑量經(jīng)口服對A 組和B 組進行攻毒，C 組僅接種100 μL PBS。攻毒后連續(xù)觀察21 d 各組雛雞的死亡情況，并記錄其臨床表現(xiàn)。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用GraphPad Prism 軟件分析處理，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean ± SEM）表示，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺失株C79-13ΔsptP及其互補株的鑒定

利用引物CX1/CX2 分別對篩選的雞白痢沙門菌C79-13、C79-13ΔsptP：：Cm 和C79-13ΔsptP基因組進行PCR 擴增，分別出現(xiàn)了2 160 bp、1 561 bp和631 bp 的條帶（圖1-A），然后對擴增的631 bp的條帶進行回收、純化和測序，擴增結(jié)果和測序結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果一致，表明成功構(gòu)建了缺失株C79-13ΔsptP。分別利用引物H1/H2 和CX1/CX2 對篩選C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）基因組進行PCR 擴增，分別出現(xiàn)391 bp 和631 bp 的條帶（圖1-B），擴增結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，證明成功構(gòu)建了缺失株C79-13ΔsptP的互補株C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）。

圖1 雞白痢沙門菌sptP 基因缺失株（A）及其互補株（B）的PCR 鑒定

2.2 C79-13ΔsptP的生長和生化特性測定

如圖2 所示，繪制的雞白痢沙門菌C79-13、C79-13ΔsptP和C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）的生長曲線基本一致，在生長速度上沒有明顯差異（P＞0.05），說明缺失sptP對雞白痢沙門菌C79-13 的生長特性沒有影響。生化特性測定結(jié)果顯示，3 株細(xì)菌的生化特性一致，均能發(fā)酵葡萄糖、甘露糖、甘露醇、鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶，而不能發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、山梨醇、乳糖、丙二酸鹽、尿素、L-阿拉伯糖和硫化氫等，說明缺失sptP不影響雞白痢沙門菌C79-13 的生化特性。

2.3 C79-13ΔsptP的毒力測定

毒力測定結(jié)果見表2，雞白痢沙門菌C79-13 對2 日齡雛雞的LD50為3.16 × 106CFU，缺失株C79-13ΔsptP對雛雞的LD50大于1.00 × 109CFU，互補株C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）對雛雞的LD50為6.90× 106CFU，C79-13ΔsptP的LD50至少是其親本野生株C79-13 的316.5 倍，說明缺失sptP會引起雞白痢沙門菌毒力的顯著下降，當(dāng)回補了sptP基因時，其毒力也隨之回復(fù)。

圖2 C79-13、C79-13ΔsptP 和C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）的生長曲線

表2 C79-13、C79-13ΔsptP 和C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）的毒力測定

2.4 免疫后雛雞的體重變化及臨床表現(xiàn)

雞白痢沙門菌減毒株C79-13ΔsptP經(jīng)口服途徑免疫3 日齡雛雞后不同天數(shù)各組雛雞的平均體重見表3，免疫組與對照組雞群之間的體重差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。與對照組一樣，免疫組雛雞的狀態(tài)表現(xiàn)正常，未出現(xiàn)厭食、腹瀉、精神萎靡或死亡等臨床癥狀。

表3 免疫后不同天數(shù)雛雞體重變化情況

2.5 血清IgG水平的測定

經(jīng)口服免疫后減毒株C79-13ΔsptP誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生的血清IgG 水平檢測結(jié)果見圖3，免疫組雛雞血清IgG 水平在免疫后第7、14 與21 天均顯著高于對照組（P＜ 0.05），說明C79-13ΔsptP能夠顯著誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。

圖3 雛雞血清IgG 水平的測定

2.6 外周血淋巴細(xì)胞增殖活性測定

結(jié)果如圖4 所示，免疫組雞群外周血淋巴細(xì)胞增殖活性在免疫后第7、14 與21 天均顯著高于對照組（P＜ 0.05），說明C79-13ΔsptP能夠顯著誘導(dǎo)雞群產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖4 雛雞外周血淋巴細(xì)胞增殖活性的測定

2.7 攻毒試驗

于免疫后第10 天利用雞白痢沙門菌減毒株C79-13ΔsptP的親本強毒株C79-13 進行攻毒，連續(xù)觀察21 d，結(jié)果顯示，與存活狀態(tài)良好的C 組雞群相比，A 組雞群有輕微的厭食、腹瀉及精神萎靡等臨床癥狀出現(xiàn)，4-7 d 即可恢復(fù)，未出現(xiàn)死亡病例，而B 組則有嚴(yán)重的厭食、腹瀉、精神萎靡等臨床癥狀出現(xiàn)，最后全部死亡，說明減毒株C79-13ΔsptP為雞群提供了良好的免疫保護。

3 討論

生物技術(shù)的飛速發(fā)展為研究病原微生物的致病機理提供了豐富的技術(shù)手段。當(dāng)前，已有許多沙門菌毒力因子被鑒定，基因sptP便是其中之一。沙門菌侵入宿主細(xì)胞后可通過在形成沙門菌液泡（SCV）來逃避宿主細(xì)胞的清除作用，并在SCV 內(nèi)進行存活和增殖［13］。研究顯示，SptP 蛋白具有酪氨酸磷酸酶活性，可促進沙門菌在SCV 內(nèi)的增殖，并且該蛋白還具有負(fù)調(diào)控MAPK 等信號通路的功能；sptP基因的缺失會引起腸炎沙門菌的毒力顯著下降，且該缺失株保留了良好的免疫原性［7，9，14］，但sptP基因缺失在雞白痢沙門菌中的相關(guān)研究報道尚未見到。

目前，λ-red 同源重組技術(shù)被廣泛用于大腸桿菌、沙門菌等細(xì)菌的基因缺失株構(gòu)建，并且該技術(shù)不會對缺失基因的下游基因產(chǎn)生極性效應(yīng)［15］。本研究首先利用λ-red 同源重組技術(shù)構(gòu)建了雞白痢沙門菌C79-13 的sptP基因缺失株C79-13ΔsptP，發(fā)現(xiàn)缺失sptP基因?qū)﹄u白痢沙門菌C79-13 的生長和生化特性均沒有影響，說明sptP基因?qū)﹄u白痢沙門菌的生長代謝沒有影響；毒力試驗結(jié)果表明，sptP基因與雞白痢沙門菌的致病性密切相關(guān)，其缺失會引起雞白痢沙門菌的毒力顯著下降，且sptP缺失引起雞白痢沙門菌毒力下降的幅度大于SPI2、spiC、crp、asd、fur及speDE等毒力因子缺失引起雞白痢沙門菌毒力下降的程度［11，16-18］。有研究顯示，在腸炎沙門菌缺失sptP基因后，其對腸炎沙門菌生長和生化特性均沒有影響，但引起腸炎沙門菌對小鼠毒力的顯著下降，這與本研究結(jié)果一致［7］。

理想的疫苗，尤其是減毒活疫苗應(yīng)該是無毒性的。SG9R 因為其殘留的毒性和有爭議的保護效果一直為人們所詬?。?9］。有報道顯示，雞白痢沙門菌SPI2、spiC、crp、asd、fur及speDE等毒力因子缺失株可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生顯著的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，為雛雞提供高效的免疫保護效力［11，16-18］，這些研究為沙門菌減毒疫苗的研發(fā)提供了良好的數(shù)據(jù)。本研究結(jié)果表明，雞白痢沙門菌減毒株C79-13ΔsptP以1.0 × 108CFU 的劑量經(jīng)口服免疫3 日齡雛雞后并不影響其生長性能，也不會引起就雞群的任何不良反應(yīng)，這是疫苗安全性評價的一個重要指標(biāo)。通常情況下，免疫后減毒沙門菌能夠誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫，其免疫應(yīng)答水平的高低也是評價沙門菌減毒疫苗免疫效果好壞的一項重要指標(biāo)［20］。我們通過檢測血清IgG 的水平評價了減毒株C79-13ΔsptP誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答的能力，結(jié)果顯示，體液免疫應(yīng)答水平被顯著誘導(dǎo)。血液中T 淋巴細(xì)胞的增殖活性可間接反映機體細(xì)胞免疫的水平，外周血中成熟淋巴細(xì)胞的數(shù)量也反映著動物機體細(xì)胞免疫的功能強弱［6］。本研究中的外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗結(jié)果顯示，減毒株C79-13ΔsptP能夠顯著誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。攻毒試驗結(jié)果表明，減毒株C79-13ΔsptP對雛雞提供了有效的免疫保護。以上結(jié)果表明，雞白痢沙門菌減毒株C79-13ΔsptP具有作為疫苗候選株的潛力。有研究顯示，sptP基因缺失的減毒腸炎沙門菌經(jīng)免疫后可誘導(dǎo)小鼠和雛雞產(chǎn)生顯著的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，具有良好的安全性，能提供高效的免疫保護，這與本研究結(jié)果一致［9，14］。本研究僅初步表明雞白痢沙門菌減毒株C79-13ΔsptP具有作為減毒活疫苗的潛力，但后續(xù)還有很多工作需要去完成，如免疫途徑的選擇、最佳免疫劑量的探索等，均有待于進一步研究。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了雞白痢沙門菌減毒株C79-13ΔsptP，基因sptP的缺失會引起雞白痢沙門菌的毒力顯著下降。經(jīng)口服免疫后，C79-13ΔsptP不影響雛雞的生長性能，能夠誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生顯著的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，為雛雞提供高效的免疫保護效力，具有作為雞白痢減毒口服疫苗的潛力。