劉亞苓 于營 魯海坤 雷慧霞 隋昕 郭靖

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

細辛（Asarum sieboldiiMiq.）為多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)常用中藥材［1］。葉枯病是細辛的主要病害，由菌刺孢屬（Mycocentrospora）真菌槭菌刺孢（Mycocentrospora acerina）侵染所致，發(fā)生普遍且發(fā)病嚴重度高［2］。發(fā)生嚴重時病斑腐爛、穿孔，甚至整個葉片枯萎，嚴重影響藥材的產(chǎn)量。目前，生產(chǎn)上細辛葉枯病的防治主要采用化學(xué)方法，但化學(xué)防治所造成的環(huán)境污染、藥物殘留等問題日益顯現(xiàn)。生物防治具有生態(tài)安全、無殘留、特應(yīng)性強等優(yōu)點，在藥用植物病害防治上具有明顯的優(yōu)勢。目前，尚未有細辛葉枯病生物防治方法的相關(guān)報道，細辛作為傳統(tǒng)常用中藥材，亟待尋找生態(tài)安全的方法防治葉枯病。

側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）作為一種多功能菌，是生物防治研究的熱點，對多種植物病害都有廣譜的抑制作用［3-4］。目前，對側(cè)孢短芽孢桿菌抑制病原菌機制的研究主要是對其不同代謝產(chǎn)物抗菌活性的研究。多項研究表明，側(cè)孢短芽孢桿菌可產(chǎn)生多種具有抗菌作用的活性代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)生的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、抗菌肽等外泌蛋白對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）以及小麥赤霉病菌（Gibberella sanbinetti）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）等多種植物病原菌均有廣譜抑菌作用［3-6］。其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的側(cè)孢菌胺，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有抑制作用［7］。趙璟等［8］篩選出的側(cè)孢短芽孢桿菌A-60，其產(chǎn)生的抗菌肽BL-A60 可抑制辣椒疫霉菌菌絲的生長、孢子囊產(chǎn)生和休止孢子的萌發(fā)。任召珍等［9］研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)孢短芽孢桿菌LH-1 產(chǎn)生的抗菌肽可使菌體細胞膜脂雙層外側(cè)發(fā)生扭曲，細胞膜發(fā)生相變，從而導(dǎo)致菌體死亡。而側(cè)孢短芽孢桿菌抑制植物病原菌的分子機制的研究鮮見報道。

本實驗室前期獲得一株對細辛葉枯病菌具有較好拮抗效果的側(cè)孢短芽孢桿菌S2-31 菌株，皿內(nèi)抑菌和盆栽試驗的結(jié)果證明該菌株對細辛葉枯病具有較好的防治作用［10］，而國內(nèi)外尚未見側(cè)孢短芽孢桿菌拮抗細辛葉枯病菌的相關(guān)報道。隨著生物信息學(xué)和組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)已成為應(yīng)用最為廣泛的研究手段。通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）可以獲得菌株在RNA 水平基因表達的相關(guān)信息，從而獲得不同處理的基因表達水平的差異。本研究擬通過對側(cè)孢短芽孢桿菌S2-31 菌株拮抗下的細辛葉枯病菌的轉(zhuǎn)錄組測序，分析S2-31 菌株抑制病原菌表達的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，探究側(cè)孢短芽孢桿菌抑制葉枯病菌的分子機制，旨為側(cè)孢短芽孢桿菌作為細辛葉枯病生防菌的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌 細辛葉枯病菌——槭菌刺孢（Mycocentrospora acerina）由本實驗室分離鑒定及保存。將病原菌于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，備用。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基和Luria-Bertani（LB）肉湯培養(yǎng)基。

1.1.3 供試拮抗菌 本實驗室分離的1 株對細辛葉枯病具有較好拮抗效果的側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus），菌株編號為S2-31，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.18015。

1.2 方法

1.2.1 側(cè)孢短芽孢桿菌對細辛葉枯病菌菌絲生長的影響 采用平板對峙的方法，取直徑5 mm 的葉枯病病原菌菌餅（PDA 培養(yǎng)基），接種于PDA 平板的中央，在距離中心約2.5 cm 的位置劃線接種活化好的側(cè)孢短芽孢桿菌進行對峙培養(yǎng)，每板接種3 次，以只接種葉枯病菌菌餅的平板為對照，每處理重復(fù)3 次，25℃恒溫培養(yǎng)7 d［10］。觀測抑菌效果并取病原菌菌落邊緣的菌絲顯微鏡下進行形態(tài)觀察。

1.2.2 側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵液對葉枯病菌基因表達的影響

1.2.2.1 樣品制備 將100 mL PDB 液體培養(yǎng)基裝入250 mL 錐形瓶中，滅菌后，接入直徑5 mm 的葉枯病菌菌餅5 個，160 r/min、25℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h。同時，將在NA 培養(yǎng)基上活化好的S2-31 菌株接入裝有150 mL LB 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，160 r/min、32℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h，用無菌濾膜過濾除去菌體。取S2-31 的發(fā)酵培養(yǎng)濾液50 mL，加入接有葉枯病菌的PDB 液體培養(yǎng)基中（記為S 組），以加入相同體積的蒸餾水為對照（記為CK 組），每處理重復(fù)3 次，在160 r/min、25℃條件下振蕩培養(yǎng)4 d 后用紗布過濾菌絲體，無菌蒸餾水洗滌，凍干后于-80℃保存，用于提取總RNA。

1.2.2.2 總RNA 提 取、 文 庫 構(gòu) 建 和Illumina 測序 用TRIzol? Reagent（Invitrogen）分別提取S 組和對照組病原菌菌絲總RNA，每處理3 個生物學(xué)重復(fù)。用DNase I（TaKaRa）去除基因組DNA。用Oligo dT將mRNA 富集后，加入破碎緩沖液（Fragmentation buffer）將mRNA 斷裂為小片段，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下利用隨機引物（Illumina）合成雙鏈cDNA。根據(jù)Illumina 的文庫構(gòu)建協(xié)議，對合成的cDNA 進行末端修復(fù)、磷酸化和‘A’堿基添加，然后對連接產(chǎn)物進行純化和片段分選，最后進行PCR 擴增，得到cDNA 文庫。構(gòu)建的文庫采用2100 Bioanalyser（Agilent）測定總RNA 的完整性和純度，并用ND-2000（NanoDrop Technologies，美國）對RNA 樣品進行定量，確保樣品質(zhì)檢合格（OD260/280=1.8-2.2，OD260/230≥2.0，RIN ≥6.5，28S：18S ≥1.0，＞2 μg）后，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2.3 測序數(shù)據(jù)的處理 經(jīng)序列測定后直接獲得的原始測序數(shù)據(jù)（Raw reads）中常含有帶接頭、質(zhì)量較差的序列。為保證信息分析的質(zhì)量，須對 raw reads 進行過濾篩選，得到可供后續(xù)分析的 clean reads。參照Grabherr 等［11］提出的方法，將所得clean reads 通過 Trinity 軟件（http：//trinityrnaseq.sf.net）進行從頭拼接組裝（de novoassembly），以Trinity 拼接成的非冗余轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為后續(xù)分析的參考序列。采用EdgeR 差異分析軟件包計算log2（Fold change）及其統(tǒng)計檢驗的P值，以|log2（Fold change）|＞1 且P＜0.05 作為差異表達基因（Differentially expressed gene，DEG）的篩選條件。通過 Blastx 算法（E-value＜10-5），將篩選得到的unigene 序列與NCBI、NR（Nonredundant protein）、基因本體（Gene Ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）等公共數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對，獲得該unigene 的注釋信息。同時，利用Goatools 和KOBAS 對unigene 進行GO 功能富集和KEGG 通路分析［12］。

1.2.3 RT-qPCR 驗證 為驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性，從測序獲得的差異表達基因中選取7 個差異表達的unigene 進行RT-qPCR 驗證。以GAPDH 作為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5 軟件進行引物設(shè)計?？俁NA 提取參照2.6.2 進行，利用TransScripROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 和進行cDNA 的合成，統(tǒng)一濃度為100 ng/μL。利用TransStartRTop Green qPCR SuperMix（Transgen Biotech）試劑盒由美國ABI QuantStudio 3 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)進行RT-qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為：2 μL cDNA（100 ng/μL）、0.8 μL 上下游引物（10 μmol/L）、10 μL 2×TransStartRTop Green qPCR SuperMix 和7.2 μL ddH2O。反應(yīng)程序為：94℃ 30 s；94℃ 5 s；退火溫度56℃，共40 個循環(huán)，結(jié)果采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析。每個樣品3 個平行，3 次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 側(cè)孢短芽孢桿菌對細辛葉枯病菌的抑制作用

如圖1 所示，對照組的葉枯病菌菌絲粗細均勻，表面光滑；經(jīng)側(cè)孢短芽孢桿菌對峙培養(yǎng)后，葉枯病菌菌落邊緣菌絲出現(xiàn)皺縮、扭曲等現(xiàn)象，并且在對峙培養(yǎng)的菌落邊緣產(chǎn)生了大量的厚垣孢子，表明葉枯病菌的菌絲生長受到抑制。

圖1 S2-31 對峙培養(yǎng)對葉枯病菌菌絲形態(tài)的影響

2.2 測序結(jié)果的評估

供試6 個樣本過濾掉低質(zhì)量的序列reads 后得到的序列的clean reads 如表1 所示，滿足Q30 標準的堿基數(shù)均達到91%以上，GC 含量比例均在35%-65%之間。經(jīng)de novo拼接組裝后，共得到17 069條單基因，其平均長度為3 385.86 bp，N50 為6 120 bp。這表明測序質(zhì)量較高，適合用于后續(xù)分析。

表1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.3 差異表達分析

與對照組相比，經(jīng)側(cè)孢短芽孢桿菌處理后的葉枯病菌（S）中有3 681 個DEGs，其中2 224 個相對上調(diào)，1 457 個相對下調(diào)（圖2）。對其進行聚類分析，S 組與CK 組的基因差異表達情況如圖3 所示。

2.4 差異表達基因的GO功能分析

對3 681 個DEGs 進行GO 功能注釋分析，得到2 355 個DEGs 的注釋信息，其中1 361 個DEGs 為上調(diào)表達，994 個DEGs 為下調(diào)表達。分別將上調(diào)和下調(diào)表達的DEGs 按GO 功能分類，注釋的前20個GO 生物學(xué)功能中，均包括生物過程（Biological process）8 個亞群、細胞組分（Cellular component）8 個亞群和分子功能（Molecular function）4 個亞群（圖4）。生物過程大類中，上調(diào)表達的DEGs 主要分布在代謝過程（Metabolic process），其次是細胞進程（Cellular process）；下調(diào)表達的DEGs 主要分布在細胞進程，其次是代謝過程。細胞組成大類中，上調(diào)表達的DEGs 在膜（Membrane）、膜組分（Membrane part）中分布較多；下調(diào)表達的DEGs 在細胞組分（Cell part）和細胞（Cell）中分布較多。分子功能大類中，上調(diào)和下調(diào)表達的DEGs 均主要分布在催化活性（Catalytic activity）和結(jié)合（Binding）兩個亞群中。菌絲生長是菌絲頂端細胞擴張的過程，細胞、細胞組分、膜、膜組分等細胞組成部分和細胞進程等生物過程均與菌絲細胞的生長、擴張密切相關(guān)。

圖2 不同處理葉枯病菌DEGs 火山圖

2.5 差異表達基因的KEGG富集分析

進一步利用KEGG 富集分析3 681 個差異表達基因，定位到115 條生物學(xué)通路，主要包括代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic information processing）、細胞過程（Cellular processes）、環(huán)境信息處理（Environmental information processing）和生物體系統(tǒng)（Organismal systems）5 大類途徑，其中，代謝途徑富集的DEGs 最多，主要包括淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、氨基糖和核苷糖代謝（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism）以及糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定生物合成（Glycosylphosphatidylinositol（GPI）-anchor biosynthesis）等通路；其次是遺傳信息處理途徑，主要包括剪接體（Spliceosome）和RNA 聚合酶（RNA polymerase）等通路；然后是細胞過程途徑，主要包括胞吞作用（Endocytosis）和過氧化物酶體（Peroxisome）2 條通路。其中，淀粉和蔗糖代謝、剪接體和胞吞作用富集到的基因數(shù)目最多，分別為37、31 和30 個。

圖3 不同處理和重復(fù)的間DEGs 的聚類熱圖分析

圖4 S2-31 差異表達基因的GO 注釋

對2 224 個上調(diào)表達和1 457 個下調(diào)表達的DEGs 分別進行KEGG 富集分析，共有346 個上調(diào)表達的DEGs 定位到100 條KEGG 通路中，顯著富集的通路有淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、氨基糖和核苷糖代謝（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism）（圖5）；另有337 個下調(diào)表達的DEGs 定位到100 條KEGG 通路中，顯著富集的通路有遺傳信息處理途徑的剪接體通路，細胞過程途徑的胞吞作用和過氧化物酶體通路，以及代謝途徑的GPI 錨定合成通路（圖6）。其中剪接體、過氧化物酶體、胞吞作用等通路均與菌絲生長密切相關(guān)，由此推測側(cè)孢短芽孢桿菌可能通過以上通路調(diào)控病原菌菌絲的生長。

圖5 S2-31 處理組上調(diào)表達差異基因的KEGG 富集分析

圖6 S2-31 處理組下調(diào)表達差異基因的KEGG 富集分析

2.6 與菌絲生長相關(guān)代謝通路的基因差異表達分析

根據(jù)已報道的與菌絲生長發(fā)育相關(guān)的基因、蛋白及酶類，從顯著富集的通路中篩選出差異表達較為顯著的相關(guān)基因（P＜0.01）列于表2。

2.6.1 與過氧化物酶體形成有關(guān)的基因 過氧化物酶體中可發(fā)生多種生化反應(yīng)，如脂肪酸的β 氧化為菌絲生長提供能量［13］，與病原真菌的生長發(fā)育密切相關(guān)。參與過氧化物酶體形成和增殖的基因被稱為PEX 基因。本研究中，共篩選到30 個與過氧化物酶體有關(guān)的DEGs，其中，11 個DEGs 上調(diào)表達，19 個DEGs 下調(diào)表達，包括參與形成過氧化物酶體的PEX16和PEX19和參與菌絲分解的α/β 水解酶（alpha/beta-hydrolase）的編碼基因（表2）。其中PEX16和PEX19顯著下調(diào)表達（P＜0.01），分別為對照組CK 的0.148 和0.317 倍；α/β 水解酶編碼基因顯著上調(diào)表達，上調(diào)為對照組的7.412 倍。

2.6.2 與GPI 錨定相關(guān)的基因 GPI 錨定蛋白位于真菌的細胞壁，對真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換、細胞壁合成具有重要的作用。本研究中，TRINITY_DN4901_c0_g4、TRINITY_DN4400_c0_g1 和TRINITY_DN4854_c1_g10 均參與GPI 錨定生物合成通路中GPI-N-乙酰基-葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶（GPI-N-acetylglucosaminyltransferase，GPI-GnT）復(fù)合體的構(gòu)成，分別編碼PIG-A、PIG-C 和PIG-H（圖7），且都顯著下調(diào)。另外，參與GPI 和蛋白連接的GPI：轉(zhuǎn)酰胺基酶（GPI：protein transamidase）的編碼基因也顯著下調(diào)（P＜0.01），為對照組的0.291 倍（表2）。

表2 與葉枯病菌菌絲生長相關(guān)的差異表達基因

圖7 S2-31 處理組GPI 錨定生物合成通路中基因的參與情況

2.6.3 與胞吞作用有關(guān)的基因 胞吞作用是一個復(fù)雜的質(zhì)膜運輸過程，該過程參與調(diào)控真菌菌絲頂端的形態(tài)建成和真菌分生孢子的萌發(fā)。本研究共篩選到30 個與胞吞作用有關(guān)的基因，其中8 個上調(diào)表達，22 個下調(diào)表達，其中包括編碼絲狀肌動蛋白亞基和肌動蛋白骨架的基因、肌動蛋白定位等相關(guān)的基因，如Arf GTPase 激活蛋白、囊泡分揀蛋白snf7、GTP結(jié)合、絲狀肌動成帽蛋白α 亞基和肌動蛋白細胞骨架組織均顯著下調(diào)（表2）。

2.6.4 與剪接體相關(guān)的基因 剪接體相關(guān)的基因與菌絲的生長和致病性密切相關(guān)，在遺傳信息處理途徑中剪接體通路富集最為顯著，根據(jù)差異基因的差異顯著性進行篩選，ATP 結(jié)合和pre-mRNA 剪輯因子的差異更為顯著（P值分別達到1.290E-10 和1.466E-09）且表達量下調(diào)倍數(shù)較大，分別為對照組的0.156 和0.282 倍（表2）。

2.7 RT-qPCR驗證

為檢驗轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的準確性，從與菌絲生長相關(guān)的DEGs 中選取7 個差異顯著的基因進行引物設(shè)計（表3），利用RT-qPCR 對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行驗證（圖8），其中3 個上調(diào)表達基因，4 個下調(diào)表達基因。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和RT-qPCR 的驗證結(jié)果一致。

表3 RT-qPCR 驗證基因及引物設(shè)計

圖8 葉枯病菌轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的RT-qPCR 驗證

3 討論

生防細菌的抑菌機理主要是產(chǎn)生抗菌素［14-15］。側(cè)孢短芽孢桿菌作為重要的生防細菌資源，對多種植物病原微生物都具有廣譜的抑菌特性。大量研究表明，側(cè)孢短芽孢桿菌可產(chǎn)生具有抑制多種植物病原微生物生長的代謝產(chǎn)物，趙秀香等［16-17］研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)孢短芽孢桿菌B8 產(chǎn)生的抗菌蛋白使立枯絲核菌（R. solani）的菌絲斷裂、膨大、內(nèi)容物外滲，并且破壞病菌菌體細胞膜的透性，最終導(dǎo)致菌體細胞壁的消融和菌絲體消解。本研究表明經(jīng)側(cè)孢短芽孢桿菌與葉枯病菌的對峙培養(yǎng)后葉枯病菌菌落邊緣菌絲出現(xiàn)了皺縮、扭曲、膨大等現(xiàn)象，可能是由于側(cè)孢短芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌代謝物質(zhì)造成了菌絲的畸形，抑制了葉枯病菌菌絲的生長。厚垣孢子是菌絲在不良環(huán)境條件下誘導(dǎo)形成的抗性結(jié)構(gòu)［18］，經(jīng)側(cè)孢短芽孢桿菌的對峙培養(yǎng)后的葉枯病菌產(chǎn)生了厚垣孢子，說明S2-31 的對峙培養(yǎng)形成了不利于葉枯病菌生長的環(huán)境，誘導(dǎo)其產(chǎn)生了厚垣孢子。

菌絲生長是菌絲細胞頂端延伸管延伸的過程，該過程中細胞的擴張是菌絲生長的主要機制。本實驗通過對側(cè)孢短芽孢桿菌抑制后病原菌菌絲的DEGs進行GO 功能注釋和KEGG 富集分析。結(jié)果表明差異表達基因主要注釋到生物過程中的細胞過程，細胞組成中的膜、膜組分、細胞和細胞組分等，菌絲的生長是通過在菌絲尖端凝集新的質(zhì)膜，因此以上GO term 與菌絲細胞的擴張和生長緊密相關(guān)。KEGG富集分析表明差異表達基因主要富集的通路有遺傳信息處理途徑的剪接體、RNA 聚合酶通路；細胞過程途徑的胞吞作用和過氧化物酶體通路；以及代謝途徑的GPI 錨定合成通路。且下調(diào)表達的DEGs 主要富集在過氧化物酶、胞吞作用、剪接體以及GPI錨定生物合成等通路。根據(jù)顯著性篩選到的與菌絲生長發(fā)育相關(guān)的DEGs 同樣涉及到這些途徑中。

研究表明剪接體通路與菌絲生長密切相關(guān)，剪接體通路的ATP 結(jié)合蛋白和pre-mRNA 剪接是禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）菌絲生長所必需［19-20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)側(cè)孢短芽孢桿菌拮抗后病原菌菌絲的ATP 結(jié)合和mRNA 前體剪接因子的表達量顯著下降，表明菌絲生長受到抑制。

過氧化物酶體通路可參與多種生化過程，過氧化物酶體可在病菌損傷時阻塞菌絲細胞膜上的破損孔洞，起到防止胞質(zhì)外流的作用［21］。多項研究表明，稻瘟病菌（M. grisea）、瓜類植物炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、禾谷鐮刀菌（F.graminearum）等多種植物病原菌中的PEX 基因都參與過氧化物酶體的形成和增殖［22-25］。本試驗結(jié)果顯示，過氧化物酶體通路被顯著富集，通路內(nèi)的PEX16和PEX19的表達量顯著下降，表明菌絲過氧化物酶體的形成過程受阻。同時，在過氧化物酶體中脂肪酸β-氧化產(chǎn)生的乙酰輔酶A 進入乙醛酸循環(huán)［13］，實現(xiàn)脂肪到糖的轉(zhuǎn)變，進而為菌絲生長提供能量。另外，真菌細胞壁的主要成分幾丁質(zhì)是由乙酰CoA 衍生而來。Bhambra 等［26］研究表明，過氧化物酶體的缺陷阻礙了幾丁質(zhì)的合成，對菌絲細胞壁的完整性造成影響。因此S2-31 可能是通過抑制過氧化物酶體的形成從而抑制脂肪酸β-氧化、乙醛酸循環(huán)以及幾丁質(zhì)合成等過程，進而影響能量供應(yīng)和細胞壁的完整性，造成菌絲生長的缺陷。

GPI-錨定蛋白合成通路中的GPI 錨定蛋白（GPIAPs）對真菌的黏附、形態(tài)轉(zhuǎn)換和細胞壁合成等有著重要的影響。Sundstrom 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，GPI-APs Hwp1 在介導(dǎo)菌絲形成方面發(fā)揮重要作用。同時，GPI 錨定序列翻譯后，在轉(zhuǎn)酰胺基酶的作用下將GPI 連接到蛋白上，合成GPI-APs。本試驗中，編碼GPI：轉(zhuǎn)酰胺基酶的基因顯著下調(diào)，表明GPI-APs的合成受到影響。另外，GPI 錨定合成的第一步由GPI-N-乙?；?葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶（GPI-GnT）復(fù)合體催化，該復(fù)合體由PIG-A、PIG-H、PIG-C、PIG-P、GPI1、PIG-Y 和 DPM2 7 個蛋白組成，在本試驗中，編碼PIG-A、PIG-C 和PIG-H 的基因顯著下調(diào)，GPI錨定合成受到抑制。李晏等［28］研究發(fā)現(xiàn)，破壞GPI錨的結(jié)構(gòu)或阻礙其生物合成，可以阻礙白色念珠球菌（Monilia albican）細胞壁的合成，從而抑制真菌的生長。因此，側(cè)孢短芽孢桿菌可能通過抑制了GPI：轉(zhuǎn)酰胺基酶編碼基因的表達和GPI-GnT 復(fù)合體的形成，從而抑制了GPI 錨定蛋白的合成，進而影響葉枯病菌細胞壁的形成，最終抑制菌絲的生長。

胞吞作用通路在調(diào)控真菌菌絲頂端的形態(tài)建成過程中發(fā)揮重要的作用，該通路中的肌動蛋白是胞吞點形成和新的細胞骨架的生成重要參與者［29-30］。本研究中，胞吞作用通路中編碼絲狀肌動蛋白成帽蛋白α 和肌動蛋白細胞骨架組織的基因表達量均顯著下調(diào)，表明肌動蛋白和細胞骨架的形成受到影響。胞吞作用通路中的Arf GTPase 激活蛋白和囊泡分揀蛋白snf7 與囊泡的形成和運輸有有關(guān)，在本實驗中其編碼基因分別下調(diào)了0.165 和0.159 倍。劉秀等［31］研究表明，稻瘟病菌（M. grisea）Arf GTPase 缺失突變體的營養(yǎng)菌絲生長減慢，侵染菌絲減少且生長減慢。周晨等［32］研究表明，稻瘟病菌中與囊泡運輸相關(guān)基因的缺失導(dǎo)致胞吞作用受到不同程度的影響，缺失突變體在分生孢子的產(chǎn)生、萌發(fā)及細胞壁完整性等方面存在缺陷。側(cè)孢短芽孢桿菌可能通過引起胞吞作用中與編碼肌動蛋白相關(guān)和囊泡相關(guān)的基因下調(diào)表達從而抑制了菌絲的生長。

4 結(jié)論

側(cè)孢短芽孢桿菌可以抑制細辛葉枯病菌菌絲的生長；對S2-31 拮抗下葉枯病菌的轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，病菌生長受阻可能與GPI 錨定、胞吞作用和過氧化物酶體、剪接體等通路的調(diào)控相關(guān)，但具體的機制還需進一步研究。本研究結(jié)果為進一步研究側(cè)孢短芽孢桿菌抑制細辛葉枯病菌的機制及S2-31菌株的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。