陳杰豪 繆玉佳 梁超 陶雨 歐陽萍 汪開毓 耿毅 石存斌李寧求

（1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種典型的革蘭氏陰性短桿菌，為人-獸-魚共患病病原，廣泛存在于各種水環(huán)境中，主要能夠感染水生動(dòng)物并引起嚴(yán)重的疾病，如鰻鱺赤鰭病和潰瘍綜合征等［1-3］。在美國，嗜水氣單胞菌的爆發(fā)導(dǎo)致了水生養(yǎng)殖動(dòng)物的大量死亡，每年都會(huì)造成了數(shù)百萬美元的損失［4］。王春瑞等［5］對(duì)中國東部地區(qū)11 個(gè)淡水養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示在4-11 月間嗜水氣單胞菌相關(guān)疾病發(fā)病率高達(dá)73%，死亡率為20%-30%。嗜水氣單胞菌可以通過患病魚類、污染水源和未煮熟的食物傳染給人類，導(dǎo)致腹瀉、食物中毒、繼發(fā)性感染、敗血癥和多種疾病［6-7］。

抗生素是目前治療嗜水氣單胞菌感染的主要藥物。然而，耐藥性、藥物殘留以及環(huán)境污染等現(xiàn)象逐漸增多，嚴(yán)重限制了抗生素對(duì)嗜水氣單胞菌感染的治療［8］。同時(shí)，嗜水氣單胞菌的耐藥菌株具有廣泛的耐藥譜和較高的耐藥率［9］，對(duì)β-內(nèi)酰胺類耐藥率為61.54%-100%，對(duì)四環(huán)素耐藥率為23.26%-92.31%，對(duì)喹諾酮類耐藥率為6.98%-100%［10-11］。因此，為防止臨床上治療嗜水氣單胞菌感染陷入無藥可用的處境，迫切需要研發(fā)一種低耐藥、無殘留且無選擇壓力的藥物。

近年來，從植物中提取的天然化合物在體外表現(xiàn)出良好的抑菌活性，已被廣泛用于治療微生物感染［12］。山姜素，是一種黃酮類化合物，主要存在于姜科植物和雙子葉植物中［13］，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的藥理活性如抗菌、抗炎、抗腫瘤等［14-15］，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其毒性低、穩(wěn)定性好、易獲取等特點(diǎn)［16］，因此有潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山姜素體外對(duì)嗜水氣單胞菌具有很好的抑制作用。然而，山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌機(jī)制尚不清楚。本研究開展了山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制機(jī)制研究，旨為山姜素用于防控嗜水氣單胞菌感染提供理論依據(jù)和奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

耐藥性嗜水氣單胞菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水生動(dòng)物疾病實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存。山姜素（HPLC 純度＞98%；CAS no. 104-55-2）購于成都瑞芬思有限公司，溶于二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich，美國）中，制成濃度為40.96 mg/mL 的原液備用。

1.2 方法

1.2.1 山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌抑菌活性和生長曲線測(cè)定 參照CLSL（Clinical and Laboratory Standards Institute）上所描述的方法［17］，用微量倍比稀釋法測(cè)定了山姜素對(duì)耐藥性嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC），向含有LB 液體培養(yǎng)基的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入山姜素，在終藥物濃度為512 μg/mL 至8 μg/mL 的范圍內(nèi)連續(xù)2 倍稀釋。隨后在每個(gè)試驗(yàn)孔中加入5 μL 菌液，在28℃下與山姜素共培養(yǎng)24 h。根據(jù)MIC 試驗(yàn)結(jié)果，并參照Wilson 等［18］所描述的方法，使用LB 平板（含1.5%瓊脂的LB 液體培養(yǎng)基）方法測(cè)定了山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌的最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）。對(duì)照組用相同體積的DMSO處理。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

為了確定山姜素對(duì)菌株CW 生長曲線的影響，在400 mL 新鮮LB 液體培養(yǎng)基中加入4 mL 過夜培養(yǎng)的菌液。當(dāng)吸光度達(dá)到0.3（OD600nm=0.3）時(shí)，將400 mL 的細(xì)菌培養(yǎng)物均勻分裝于8 個(gè)250 mL 的錐形瓶，加入山姜素，終藥物濃度為0、8、16、32、64、128 和256 μg/mL，置于氣浴恒溫振蕩器（28℃，150 r/min）培養(yǎng)24 h。使用分光光度計(jì)，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定培養(yǎng)基OD600nm值以評(píng)估山姜素對(duì)菌株CW生長的影響。

1.2.2 山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 菌株CW 在新鮮的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600nm=1.0），以終藥物濃度為2MIC 的山姜素處理，共培養(yǎng)4 h 后，用無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH7.4）洗滌菌體3 次，離心（4 500 r/min，4℃，10 min）收集下層沉淀，然后在4℃下重懸于2.5%戊二醛，以進(jìn)行掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）分析［19-21］。為進(jìn)行透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）分析，上述菌液在共培養(yǎng)8 h 和16 h 后，用無菌PBS 洗滌3 次，離心收集后，按透射電鏡樣品制備方法制備測(cè)定［22］。對(duì)照組用相同體積的DMSO 處理。

1.2.3 山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌膜通透性的影響 參照Bendali［23］、張冠楠等［24］報(bào)道的方法，測(cè)定山姜素對(duì)菌株CW 膜通透性的影響，即將菌株CW 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600nm=1.0），用無菌PBS 洗滌3 次，離心收集下層沉淀，以5%葡萄糖溶液重懸為1×107CFU/mL 的菌懸液，加入終藥物濃度為2MIC 的山姜素，28℃靜置培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)離心收集上清液，并立即用于測(cè)定電導(dǎo)率。對(duì)照組用相同體積的DMSO 處理。

1.2.4 山姜素作用嗜水氣單胞菌的SDS-PAGE 分析 將100 mL 已培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600nm=1.0）的菌懸液，平均分裝于2 個(gè)250 mL 的錐形瓶，加入終濃度為2MIC 的山姜素，對(duì)照組用相同體積的DMSO處理，置于氣浴恒溫振蕩器（28℃，150 r/min）中共培養(yǎng)，培養(yǎng)4、8、16 和24 h 后取樣，用無菌PBS洗滌3 次，離心收集菌體沉淀，重懸于1 mL 無菌PBS 中，試驗(yàn)組與對(duì)照組OD600nm值一致。超聲破碎儀破碎菌體后，離心收集上清液。取40 μL 上清液與10 μL 5×上樣緩沖液混勻，煮沸處理10 min。取5 μL 進(jìn)行凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)R250 染色過夜，煮沸脫色后，凝膠成像儀拍照。

1.2.5 山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌乳酸脫氫酶含量的影響 將終藥物濃度為2MIC 的山姜素與已培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600nm=1.0）的菌液混勻，置于氣浴恒溫振蕩器（28℃，150 r/min）中共培養(yǎng)。在0、1、2、4、6 和8 h 取樣，用無菌PBS 洗滌3 次，離心收集菌體沉淀，重懸于1 mL 無菌PBS 中，調(diào)試驗(yàn)組與對(duì)照組OD600nm值一致。超聲破碎儀破碎菌體后，離心收集上清液，用乳酸脫氫酶試劑盒（南京建成）測(cè)定上清液中LDH 的含量。對(duì)照組用相同體積的DMSO處理。

1.2.6 山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌DNA 外滲量的影響 將吸光度達(dá)到1.0（OD600nm=1.0）的菌懸液洗滌、重懸于無菌PBS 中，使?jié)舛葹?×107CFU/mL。加入終藥物濃度為2MIC 的山姜素，28℃靜置培養(yǎng)。共培養(yǎng)0、1、2、4、6 和8 h 取樣，離心（4 500 r/min，4℃，10 min）收集上清液，用微量分光光度計(jì)NanoDrop One 測(cè)定上清液中DNA 含量［25］。對(duì)照組用相同體積的DMSO 處理。

1.2.7 山姜素作用嗜水氣單胞菌的DAPI 染色觀察 在用無菌PBS 洗滌、重懸后濃度為1×107CFU/mL 的菌懸液中，加入終藥物濃度為2MIC 的山姜素，對(duì)照組用相同體積的DMSO 處理，28℃靜置培養(yǎng)。在0、2、4 和8 h 分別取樣，用無菌PBS 洗滌3 次，離心（8 000 r/min，4℃，3 min）收集下層沉淀，4%多聚甲醛處理10 分鐘，然后離心并重懸于1 mL 無菌PBS 中。各取500 μL 樣品，分別與500 μL 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，4’，6-diamidino-2-phenylindole，10 μg/mL）染料混勻，在暗室中反應(yīng)10 min。樣品再次離心（8 000 r/min，4℃，3 min），用無菌PBS 洗滌3 次，去除剩下的DAPI 染料。樣品重新懸浮于200 μL 無菌PBS 中，各取5 μL 樣品加在無菌載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察菌體情況。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（t檢驗(yàn)）。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC和MBC值

對(duì)從不同來源的5 株嗜水氣單胞菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和抑菌活性試驗(yàn)，研究山姜素對(duì)不同來源的嗜水氣單胞菌是否存在抑菌差異。結(jié)果如表1 所示，山姜素表現(xiàn)出良好的體外抑菌效果，對(duì)分離株的MIC 和MBC 值 分 別 為128-256 μg/mL 和512-1 024 μg/mL，無明顯差異。山姜素對(duì)菌株CW 的MIC 和MBC 值分別為128 μg/mL 和256 μg/mL，且菌株CW對(duì)多種抗生素均表現(xiàn)出耐藥性，故選擇CW 株為代表進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌生長的影響

山姜素對(duì)菌株CW 生長的影響結(jié)果如圖1 所示，用8、16 和32 μg/mL 山姜素處理的試驗(yàn)組顯示出與對(duì)照組相似的生長曲線；山姜素在濃度為64 μg/mL時(shí)對(duì)菌株CW 生長的抑制作用較弱，但當(dāng)濃度為128 μg/mL 和256 μg/mL 時(shí)對(duì)菌株CW 的生長有著顯著的抑制作用。

2.3 山姜素對(duì)菌體形態(tài)的影響

經(jīng)或未經(jīng)山姜素處理的嗜水氣單胞菌菌體的超微結(jié)構(gòu)變化如圖2 所示。在4 h 時(shí)，對(duì)照組的菌體表面光滑且邊緣清晰，通常為短桿狀，在掃描電鏡下單個(gè)或成對(duì)排列而無分支（圖2-A），山姜素處理組菌體表面顯示皺褶和萎縮，部分菌體甚至變形（圖2-B）。在8 h 和16 h 時(shí)，透射電鏡圖像顯示，對(duì)照組的菌體結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)和核區(qū)明顯，菌體分裂間隔正常（圖2-C、E）。相反地，山姜素處理組在8 h 和16 h 的菌體超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出不同程度的損傷。山姜素處理8 h 后，多數(shù)細(xì)菌菌體皺縮明顯，部分菌體細(xì)胞質(zhì)流失、胞漿消失，出現(xiàn)內(nèi)部空化的現(xiàn)象（圖2-D）。處理16 h 后，菌體被嚴(yán)重破壞，多數(shù)菌體內(nèi)容物流失、內(nèi)部空化，部分菌體細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)模糊不清（圖2-F）。

表1 山姜素對(duì)5 株不同魚源嗜水氣單胞菌的MIC 值和MBC 值

圖1 山姜素對(duì)菌株CW 生長的影響

圖2 山姜素不同作用時(shí)間對(duì)菌體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.4 山姜素對(duì)菌體膜通透性的影響

菌株CW 與山姜素共培養(yǎng)后，通過測(cè)量菌懸液的電導(dǎo)率推斷膜通透性的變化［26］。由圖3 可知，與對(duì)照組相比，山姜素處理組菌懸液的電導(dǎo)率整體表現(xiàn)出更高的趨勢(shì)（P＜0.05）。與0 h 相比，山姜素作用2 h 后，電導(dǎo)率增加3.97%（P＜0.05），并在4 h達(dá)到最大值4.60%（P＜0.05）。相反，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組的電導(dǎo)率沒有顯著變化。

2.5 山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌可溶性蛋白的影響

用SDS-PAGE 測(cè)定了山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌可溶性蛋白的影響。由圖4 可知，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)蛋白條帶無顯著變化（圖4 通道1、3、5 和7）。相對(duì)地，山姜素處理組在16 h 和24 h，顯示出數(shù)量更多、更為清晰明亮的蛋白條帶（圖4通道6 和8），結(jié)果表明山姜素可影響嗜水氣單胞菌可溶性蛋白的表達(dá)。

2.6 山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌乳酸脫氫酶的影響

乳酸脫氫酶含量的測(cè)定結(jié)果如圖5 所示，培養(yǎng)1、2、6 和8 h 后，山姜素處理組LDH 含量明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。與同一時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，山姜素處理中LDH 含量分別上調(diào)了22.88%、26.09%、21.34%、26.66% 和30.95%（P＜0.01）， 結(jié)果表明山姜素能刺激嗜水氣單胞菌LDH 含量的增加。

圖3 山姜素對(duì)菌懸液電導(dǎo)率的影響

圖4 山姜素對(duì)菌株CW 可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

2.7 山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌DNA外滲量的影響

DNA 本身為大分子物質(zhì)，正常情況下不會(huì)穿透完整的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，在此利用DNA 的外滲來驗(yàn)證山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌細(xì)胞壁的影響。由圖6 可知，在相同的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，山姜素處理組的細(xì)胞外DNA 含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。此外，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)8 h 后，細(xì)胞外DNA 含量達(dá)到峰值，增加了13.08 μg/mL（P＜0.01）。因此，山姜素能顯著增加嗜水氣單胞菌細(xì)胞壁的通透性，提高了DNA的外滲量。

2.8 山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌DNA的影響

采用DAPI 染料對(duì)嗜水氣單胞菌的DNA 進(jìn)行染色觀察，在對(duì)照組中觀察到高強(qiáng)度、高密度的熒光染色（圖7-A）。山姜素處理組隨著作用時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度和密度逐漸降低（圖7-B-D），在培養(yǎng)8 h 后，菌懸液只有微弱的熒光強(qiáng)度（圖7-D）。

圖5 山姜素對(duì)菌株CW 的LDH 含量的影響

圖6 山姜素對(duì)菌株CW DNA 外滲量的影響

3 討論

嗜水氣單胞菌廣泛存在于水及淤泥等環(huán)境中，可感染魚類、爬行動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物等多種動(dòng)物，輕微疾病引起皮膚軟組織感染和腹瀉，重癥可引起敗血癥甚至死亡［27-28］。它是一種人畜共患病的典型病原菌，引起的疾病具有發(fā)病急、傳播快、范圍廣、死亡率高的特點(diǎn)?？傮w來講，嗜水氣單胞菌對(duì)魚類的感染最為普遍，危害也最為嚴(yán)重，可感染草魚、鰱魚、鯉魚、鳙魚等幾十種養(yǎng)殖魚類并引發(fā)細(xì)菌性敗血癥，發(fā)病率高達(dá)70%，給漁業(yè)養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前針對(duì)嗜水氣單胞菌感染引起的疾病主要以抗生素治療為主，抗生素使用不當(dāng)容易導(dǎo)致藥物殘留、細(xì)菌耐藥和環(huán)境污染等問題。

植物源性藥物是天然化合物，因其具有無抗藥性、無殘留、無副作用、不引發(fā)藥源性疾病，且抑菌殺菌效果明顯而備受人們關(guān)注［29-30］。本研究以山姜素為研究對(duì)象，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)5 株不同魚源的耐藥性嗜水氣單胞菌具有很好的抑菌效果。隨后，通過測(cè)定山姜素對(duì)嗜水氣單胞菌生長、菌體形態(tài)、電導(dǎo)率、乳酸脫氫酶、蛋白質(zhì)代謝和DNA 的影響，證實(shí)山姜素通過損傷細(xì)胞壁、增加細(xì)胞膜的通透性來抑制細(xì)菌生長繁殖，達(dá)到抑菌殺菌的目的。

先前研究證實(shí)植物源性藥物的抗菌活性主要表現(xiàn)為破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和抑制細(xì)菌功能［31］。細(xì)胞膜是一種天然的選擇性滲透屏障，通過阻止有害物質(zhì)如藥物、毒素和降解酶的進(jìn)入，以及允許營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，從而保護(hù)細(xì)菌［32］。透射電鏡結(jié)果顯示山姜素處理后嗜水氣單胞菌的菌體皺縮、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破損、細(xì)胞質(zhì)流失、內(nèi)部空化。在本研究中4 h 時(shí)菌液電導(dǎo)率的顯著增加也表明山姜素改變了嗜水氣單胞菌膜的通透性，使胞內(nèi)電解質(zhì)流失。Sheikh 等［33］研究證實(shí)肉桂醛等多種中藥單體也是通過提高菌體細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的流失，最終使細(xì)菌死亡。

蛋白質(zhì)是維持細(xì)菌結(jié)構(gòu)和正常功能的重要成分。可溶性蛋白為蛋白質(zhì)中的一種重要的細(xì)菌滲透調(diào)節(jié)劑，它的增加與積累可以提高細(xì)菌的保水能力，保證細(xì)菌的正常功能［34］。SDS-PAGE 結(jié)果顯示山姜素作用于嗜水氣單胞菌16 h 和24 h 后，菌懸液的蛋白表達(dá)量顯著上升。這可能是山姜素誘導(dǎo)嗜水氣單胞菌抗性蛋白及相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)菌能夠免于山姜素所引起的損傷，從而維持自身正常的生長代謝的結(jié)果，相似的結(jié)果在其他中藥單體抗菌機(jī)制研究中也有報(bào)道［35］。LDH 是一種重要的可溶性蛋白，在細(xì)菌對(duì)宿主天然免疫和生物膜形成的抗性中起著至關(guān)重要的作用［36］。LDH 試驗(yàn)結(jié)果表明，山姜素作用于嗜水氣單胞菌后，菌體LDH 含量顯著提升，這可能是山姜素刺激嗜水氣單胞菌生物酶的合成，菌體以此來抵抗山姜素的損傷和維持自身生長代謝的結(jié)果，再次驗(yàn)證了SDS-PAGE 試驗(yàn)的結(jié)果。

DNA 攜帶著RNA 和蛋白質(zhì)生物合成所必需的遺傳信息，是生物體發(fā)育和正常運(yùn)行所必需的生物大分子，正常情況下不會(huì)穿透完整的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。DAPI 染料能快速進(jìn)入活細(xì)胞中，追蹤植物、微生物、多細(xì)胞動(dòng)物和細(xì)菌細(xì)胞中的DNA，與DNA強(qiáng)結(jié)合顯示熒光，故被廣泛用于DNA 的檢測(cè)［37-38］。在本研究中DNA 外滲量檢測(cè)和DAPI 染色觀察結(jié)果顯示，山姜素的能夠損傷嗜水氣單胞菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜導(dǎo)致DNA 外滲，且DNA 外滲量與作用時(shí)間相關(guān)。

圖7 山姜素作用菌株CW DNA 后DAPI 染色觀察

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明山姜素在體外對(duì)耐藥性嗜水氣單胞菌具有較強(qiáng)的抗菌活性。山姜素發(fā)揮其體外抑菌作用的主要途徑為破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，造成內(nèi)容物的流失，抑制了細(xì)菌的生長繁殖。同時(shí)，山姜素是治療嗜水氣單胞菌感染的一種很有前途的候選藥物。然而，在未來的研究中，重點(diǎn)是用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)山姜素的有效性和毒性。