張廷煥 龍熙 郭宗義 柴捷

（1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2. 農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460）

microRNAs（miRNAs）是一種內(nèi)源性的的非編碼RNA，包含20-24 個(gè)核苷酸。目前miRNAs在各類組織或細(xì)胞中具有至關(guān)重要的生物學(xué)意義，miRNAs 主要是借助特異性位點(diǎn)（種子序列）與靶基因mRNA 3'UTR 區(qū)的靶位點(diǎn)相結(jié)合，發(fā)揮降解mRNA 或抑制翻譯的作用［1］。其中，miR-378 通過(guò)靶基因調(diào)控著多種重要的生理學(xué)和病理學(xué)過(guò)程，包括肌生成［2］、成骨分化［3］以及癌癥發(fā)生［4］等。例如，miR-378 特異性結(jié)合MyoR［2］、BMP2［5］、IGF1R［6］和caspase-3［7］等靶基因，參與了骨骼肌的發(fā)育；miR-378 可以靶向與p110α結(jié)合，調(diào)控肝臟胰島素信號(hào)，繼而起到調(diào)節(jié)葡萄糖和脂類穩(wěn)態(tài)的作用［8］；miR-378 定向調(diào)控MED13 的表達(dá)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)線粒體代謝及其系統(tǒng)能量代謝的平衡［9］。miR-378 還能與GalNT-7相結(jié)合，控制腎聯(lián)蛋白的表達(dá)量，從而調(diào)控成骨分化過(guò)程［10］。

目前已經(jīng)有很多生物信息學(xué)軟件和計(jì)算程序可用于預(yù)測(cè)miRNAs 的靶基因，但除了雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)?zāi)茏C明miRNAs 與靶基因的mRNAs 直接結(jié)合外，其他有效的實(shí)驗(yàn)手段非常有限。近年來(lái)，microRNA pulldown 技術(shù)的興起，極大地加快了miRNAs 的研究進(jìn)展。microRNA pulldown 技術(shù)主要是利用生物素標(biāo)記的miRNAs 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再利用鏈霉素與生物素的親和性將結(jié)合了靶基因的miRNAs復(fù)合體分離出來(lái)，然后用RT-PCR 或RNA-seq 等手段方法高效地對(duì)靶基因mRNA 進(jìn)行富集分析。在癌癥抑制因子miR-31 調(diào)控肝癌細(xì)胞發(fā)生的機(jī)制研究中，miR-31 pulldown 實(shí)驗(yàn)成功發(fā)現(xiàn)了miR-31 與細(xì)胞周期蛋白的靶向關(guān)系，miR-31 能夠調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的降解從而抑制肝癌細(xì)胞的發(fā)生［11］。而在miR-1827 的研究中，microRNA pulldown 成功找到miR-1827 與MDM2基因的靶標(biāo)關(guān)系，從而影響癌基因P53的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控癌癥的發(fā)生［12］。microRNA pulldown 技術(shù)在miRNAs 靶標(biāo)鑒別領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，將益于高效，精準(zhǔn)地鑒別miRNAs 的靶標(biāo)關(guān)系，同樣也為深入探索miRNAs 功能及其作用機(jī)制提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。目前已有大量研究證實(shí)除了miRNAs 種子序列和靶基因mRNA 3'UTR的經(jīng)典作用機(jī)制外，miRNAs 還具備多種非經(jīng)典的調(diào)控方式［13-14］，microRNA pulldown 為這些研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-378 除了在心臟、肌肉有高表達(dá)外，在皮下脂肪也有較高的表達(dá)豐度［15］。本實(shí)驗(yàn)將miR-378 類似物轉(zhuǎn)染至3T3-L1 細(xì)胞，探索miR-378 在脂肪細(xì)胞中的功能；根據(jù)靶標(biāo)位點(diǎn)的保守性以及促脂功能確定miR-378 潛在靶基因；采用生物素標(biāo)記的miR-378 進(jìn)行pulldown 實(shí)驗(yàn)，利用RT-PCR 對(duì)候選靶基因進(jìn)行富集分析，從而驗(yàn)證靶標(biāo)關(guān)系；再構(gòu)建miR-378 靶位點(diǎn)報(bào)告基因載體，利用雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定靶標(biāo)位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在為進(jìn)一步研究miR-378 在脂肪生成中功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為microRNA pulldown 技術(shù)在miRNAs靶標(biāo)驗(yàn)證中的可靠性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠的前體脂肪細(xì)胞（3T3-L1）、人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。試劑大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10 購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司，載體質(zhì)粒psiCHECK-2 購(gòu)自Promega 公司；DNA 提取試劑盒、RNA 提取試劑盒、Q5 超保真DNA 聚合酶和內(nèi)切酶均購(gòu)自NEB 公司；蛋白酶K、GoTaq?qPCR Master Mix 和雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)試劑盒來(lái)自Promega公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒來(lái)自O(shè)mega 公司；干擾RNA 購(gòu)自Ribobio 公司；Lipofectamine 2000 購(gòu)自Invitrogen 公司；瓊脂糖、DNA marker 購(gòu)自TaKaRa 公司；miRNA 類似物以及生物素（Bi）標(biāo)記的miRNA 均由銳博公司合成。

1.2 方法

1.2.1 油紅O 染色定量 本實(shí)驗(yàn)合成了兩種不同miRNA 類似物，分別為實(shí)驗(yàn)組miR-378 和對(duì)照組Control，其中Control 為無(wú)義序列，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔。將這兩種miRNA 類似物分別轉(zhuǎn)染到3T3-L1細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞在6 或12 孔板中分化培養(yǎng)到第8 天，用PBS（含10%福爾馬林）在室溫下固定1 h，再用蒸餾水沖洗孔板3 次。用含0.5%油紅O 染色1 h，之后用異丙醇或PBS 清洗，即可在顯微鏡下觀察。之后，用異丙醇溶解脂滴，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)550 nm吸光度值，其中脂肪分化程度和油滴大小與吸光度成正相關(guān)。

1.2.2 miRNA-378 候選靶基因篩選 本實(shí)驗(yàn)利用在 線 軟 件Targetscan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）預(yù)測(cè)miR-378 的靶基因，然后根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)在物種間保守和在脂肪細(xì)胞中的功能確定3 個(gè)候選靶基因Runx1t1、Galnt3、RAB10和1 個(gè)陰性對(duì)照基因GDF6。

1.2.3 miRNA-378 的pulldown 實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)合成了兩種不同的生物素（Bi）標(biāo)記的miRNA，即實(shí)驗(yàn)組Bi-miR378 和對(duì)照組Bi-control，其中Bi-control 為無(wú)義序列，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔。將兩種miRNA 分別轉(zhuǎn)入HEK293 細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h，miRNA 在細(xì)胞內(nèi)與靶基因mRNA 相結(jié)合，裂解細(xì)胞將二者結(jié)合物釋放出來(lái)，加入磁珠使其與生物素標(biāo)記miRNA 進(jìn)行結(jié)合，利用磁力架將復(fù)合物（磁珠、Bi-miRNA 和mRNA）捕獲下來(lái)，再對(duì)復(fù)合物進(jìn)行清洗、洗脫釋放mRNA，隨后利用反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR 檢測(cè)GDF6、Runx1t1、Galnt3、和RAB10四個(gè)靶基因的mRNA 富集程度，10 μL 反應(yīng)體系：GoTaq@qPCR Master Mix（2×）5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.2 μL，CXR 0.1 μL，cDNA 1 μL，ddH20 3.5 μL。反應(yīng)程序：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)，采用2-△△Ct方法計(jì)算基因表達(dá)量。RT-PCR 所用引物如表1。

表1 RT-PCR 擴(kuò)增引物

1.2.4 miR-378 靶位點(diǎn)報(bào)告基因構(gòu)建 從Ensembl 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ensembl.org）中下載小鼠GDF6、Runx1t1、Galnt3和RAB10基因的3'UTR 區(qū)中靶位點(diǎn)附近約400 bp 的序列，再利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0 獲得了4 對(duì)擴(kuò)增引物（表2），然后在每對(duì)引物上游5'端和下游3'端分別添加X(jué)hoI 酶切位點(diǎn)和NotI 酶切位點(diǎn)序列。通過(guò)PCR 獲得目的片段，再將其和骨架載體psiCHECK-2 進(jìn)行酶切、連接等步驟，生成含有靶位點(diǎn)的報(bào)告基因載體，再將報(bào)告基因測(cè)序驗(yàn)證其正確性。

1.2.5 熒光素酶活性測(cè)定 將4 個(gè)報(bào)告基因載體分別和兩種不同miRNA（實(shí)驗(yàn)組miR-378 和對(duì)照組control）類似物兩兩組合轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，每種組合轉(zhuǎn)染3 個(gè)孔作為生物學(xué)重復(fù)，培養(yǎng)48 h 后裂解細(xì)胞。采用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀來(lái)測(cè)量，獲得螢火蟲(chóng)熒光素酶發(fā)光值和海腎熒光素酶發(fā)光值。然后利用螢火蟲(chóng)熒光素酶發(fā)光值除以海腎熒光素酶發(fā)光值得到每種組合的相對(duì)熒光值。再對(duì)比每個(gè)報(bào)告基因載體的實(shí)驗(yàn)組（miR-378）和對(duì)照組（Control）的相對(duì)熒光值之間的變化情況，來(lái)判定該基因是否和miRNA-378 有靶標(biāo)關(guān)系。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用Excel2013 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，用SPSS 19 軟件中的Student’st-test 進(jìn)行差異顯著分析，使用Publisher2013 作圖。

表2 PCR 擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 miR-378促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)生成

為了確定miR-378 在脂肪細(xì)胞中的功能，本實(shí)驗(yàn)合成了miR-378 類似物，將其轉(zhuǎn)染到3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)分化8 d 后，利用油紅O 進(jìn)行了脂滴染色分析，結(jié)果顯示與Control 組的脂肪細(xì)胞相比，miR-378 組的脂滴出現(xiàn)了明顯的增加（圖1-A）。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)550 nm 吸光度值，對(duì)脂滴含量進(jìn)行定量分析，miR-378 組的吸光值有顯著的上升，約為Control 組的1.6 倍，與細(xì)胞表型結(jié)果完全一致（圖1-B），這說(shuō)明miR-378 刺激了脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的生成。隨后，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)兩組實(shí)驗(yàn)中與脂質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)情況，與Control 組相比，在miR-378 組中與脂質(zhì)合成相關(guān)基因PGC-1α和PPAR-γ表達(dá)量顯著上升，而與脂質(zhì)分解相關(guān)基因ATGL和CGI-58的表達(dá)量有顯著的下降（圖2）。以上結(jié)果說(shuō)明miR-378 通過(guò)增加脂質(zhì)合成和減少脂質(zhì)分解兩條途經(jīng)來(lái)促進(jìn)脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的積累。

2.2 microRNA pulldown驗(yàn)證miR-378的靶標(biāo)關(guān)系

為了探索miR-378 在調(diào)控脂肪生成中相關(guān)的靶基因，本試驗(yàn)通過(guò)篩選靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)在物種間是否保守和靶基因是否被報(bào)道參與了脂肪細(xì)胞生理功能，最終確定了3 個(gè)候選靶基因Runx1t1、Galnt3和RAB10。其中，RAB103 'UTR 與miR-378 種子序列2-8 位相結(jié)合，Runx1t1、Galnt3的3 'UTR 與其種子序列2-7 位結(jié)合，所有的結(jié)合位點(diǎn)在人、鼠、黑猩猩等5 個(gè)物種間都保守（圖3），其中，Runx1t1參與了脂肪細(xì)胞的分化而Galnt3和RAB10與脂肪細(xì)胞能量代謝相關(guān)。由于GDF63'UTR 區(qū)不包含miR-378的靶位點(diǎn)，作為陰性對(duì)照。

本實(shí)驗(yàn)采用microRNA pulldown 技術(shù)對(duì)這4 個(gè)靶標(biāo)關(guān)系進(jìn)行快速驗(yàn)證，用生物素標(biāo)記的miR-378（Bi-miR378）轉(zhuǎn)染到HEK293 細(xì)胞內(nèi)，然后捕獲到與miR-378 結(jié)合的mRNA，再通過(guò)反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR驗(yàn)證靶基因的富集情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Bi-control 組相比，Bi-miR378 組中Runx1t1、Galnt3和RAB10的富集程度有顯著的升高，其中Runx1t1富集程度上升了約6 倍，Galnt3和RAB10分別上升了約3.5 和3 倍，而陰性對(duì)照GDF6的富集在兩組中沒(méi)有發(fā)生變化（圖4）。Pulldown 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 說(shuō) 明miR-378 與Runx1t1、Galnt3和RAB10基因的mRNA 的確存在相互結(jié)合。

圖1 miR-378 增加3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂質(zhì)生成

圖2 miR-378 調(diào)控脂質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)

圖3 miR-378 與候選靶基因結(jié)合位點(diǎn)在不同物種間的序列對(duì)比

圖4 Biotin-miRNA 捕獲靶基因的富集分析

2.3 報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-378的靶位點(diǎn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-378 pulldown 的結(jié)果以及確定miR-378 的靶位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得了包含Runx1t1、Galnt3、RAB10靶位點(diǎn)的目的片段，其中GDF63'UTR 區(qū)的任意序列作為陰性對(duì)照（圖5），克隆構(gòu)建了4 個(gè)報(bào)告基因載體，再通過(guò)測(cè)序確認(rèn)插入序列的正確性（圖6）。將4 個(gè)載體分別與miR-378 類似物共轉(zhuǎn)染到HEK293 細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，分別檢測(cè)4 個(gè)報(bào)告基因相對(duì)熒光值的變化。通過(guò)與Control 組相比，發(fā)現(xiàn)在miR-378 組中Runx1t1、Galnt3和RAB10的相對(duì)熒光值有顯著的下降，其中Runx1t1相對(duì)熒光值下降了約50%，Galnt3和RAB10分別下降了約40%和30%，而GDF6的相對(duì)熒光值在兩組中沒(méi)有發(fā)生變化（圖7），說(shuō)明miR-378 是通過(guò)圖3 中預(yù)測(cè)的靶位點(diǎn)與3 個(gè)靶基因互作的。

圖5 候選基因PCR 目的片段的電泳圖

圖6 四個(gè)報(bào)告基因插入片段的測(cè)序峰圖

圖7 報(bào)告基因載體雙熒光素酶活性檢測(cè)

3 討論

miR-378 在動(dòng)物及人的各臟器組織中都有表達(dá)，其中已有大量研究表明miR-378 在脂肪組織中存在著較高的豐度［15-17］。在脂肪組織中TNF-a、IL-6和leptin等重要的脂肪分化因子調(diào)控miR-378 的生成［18］。在間充質(zhì)前體細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-378 后發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞中脂滴體積的增加［19］。小鼠全身性敲除miR-378 后出現(xiàn)了體重明顯降低，皮下脂肪體積顯著減少的現(xiàn)象，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-378 影響了甘油三酯的沉積［9］；miRNA-378 還可以控制棕色脂肪組織產(chǎn)熱，從而起到緩解肥胖的效果［20-21］。本研究通過(guò)在前體脂肪細(xì)胞3T3-L1 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-378 后，也發(fā)現(xiàn)了脂滴增加的現(xiàn)象，進(jìn)一步說(shuō)明了miR-378有促進(jìn)脂質(zhì)生成的作用。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)miR-378 能調(diào)控脂肪合成相關(guān)基因PGC-1α和PPAR-γ表達(dá)上調(diào)，其中，PPAR-γ在脂肪細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用，參與脂肪細(xì)胞的增殖、分化和代謝過(guò)程［22-23］，而PGC-1α是PPAR-γ的激活劑［24］；此外，還發(fā)現(xiàn)miR-378 可下調(diào)脂肪分解基因ATGL和CGI-58表達(dá)，其中ATGL是甘油三酯脂酶，能引發(fā)甘油三酯水解成脂肪酸［25-26］，而CGI-5是ATGL的激活劑［27-28］。這說(shuō)明在脂肪細(xì)胞中miR-378 不僅可以直接促進(jìn)脂質(zhì)合成，還可以間接降低脂質(zhì)分解，通過(guò)這兩條途徑影響脂肪總量。但在這些脂肪相關(guān)基因的3'UTR 區(qū)并沒(méi)有預(yù)測(cè)到miR-378 靶位點(diǎn)，而有研究發(fā)現(xiàn)miR-378 可促進(jìn)重要調(diào)控因子（比如C/EBPα、C/EBPβ等）的轉(zhuǎn)錄從而控制脂肪相關(guān)基因的表達(dá)［19，29］，所以miR-378 可能通過(guò)相關(guān)因子間接調(diào)控這些基因的表達(dá)水平。

miR-378 雖然可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)生成，但目前直接報(bào)道與之相關(guān)的靶基因較少，miR-378 可靶向調(diào)控MAPK1基因，促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化［18，30］。為了獲得更多與脂肪細(xì)胞相關(guān)的靶標(biāo)關(guān)系，本研究把miR-378 和靶基因結(jié)合位點(diǎn)的保守性作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)，成功證實(shí)了所有候選的靶基因，說(shuō)明如果miRNAs 與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)在物種間高度保守的話，那么這個(gè)位點(diǎn)更有可能成為靶位點(diǎn)。本研究驗(yàn)證得到miR-378 的一個(gè)與脂肪合成直接相關(guān)的靶基因Runx1t1，它是脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)合成的抑制因子，過(guò)表達(dá)Runx1t1會(huì)抑制脂質(zhì)的生成，前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中Runx1t1的表達(dá)下調(diào)［31-33］。同時(shí)還獲得了miR-378 兩個(gè)與脂肪細(xì)胞能量代謝相關(guān)的靶基因，其中Rab10特異性地參與了脂肪細(xì)胞中胰島素調(diào)控的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程［34-36］，而Galnt3通過(guò)與FGF23結(jié)合調(diào)控脂肪細(xì)胞肥大和胰島素敏感［37-38］。這些靶標(biāo)關(guān)系的獲得為進(jìn)一步探索miR-378 在脂肪細(xì)胞中的功能提供了理論依據(jù)。

報(bào)告基因克隆的傳統(tǒng)miRNAs 靶標(biāo)驗(yàn)證手段不但低效而且假陽(yáng)性率較高，而近年來(lái)隨著miRNAs作用機(jī)制的多元化以及高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，目前很多研究已證實(shí)microRNA pulldown 技術(shù)在miRNAs 靶標(biāo)驗(yàn)證上的高效、快捷、批量等特點(diǎn)［39-41］，但由于miRNAs 與mRNA 的結(jié)合方式是以種子序列與靶位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)配對(duì)為主，這也必然導(dǎo)致microRNA pulldown 的結(jié)果也會(huì)呈現(xiàn)出較高概率的假陽(yáng)性。而本研究利用microRNA pulldown 技術(shù)高效快速地證明了miR-378 與Runx1t1、Rab10和Galnt3mRNA 的相互作用，再運(yùn)用報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步確定了靶標(biāo)關(guān)系以及相互結(jié)合靶位點(diǎn)，這說(shuō)明兩個(gè)技術(shù)相結(jié)合可以大大降低了假陽(yáng)性的出現(xiàn)。本研究不僅確認(rèn)了miR-378 在脂肪細(xì)胞中的靶向目標(biāo)，同時(shí)也為microRNA pulldown 技術(shù)的結(jié)果提供了一定的數(shù)據(jù)支撐。但隨著miRNAs 多樣化調(diào)控方式研究的深入［13］，microRNA pulldown 技術(shù)也必將更適合miRNAs 復(fù)雜的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了在脂肪細(xì)胞中miR-378 能促進(jìn)脂質(zhì)生成且影響脂肪合成和分解相關(guān)基因的表達(dá)水平，還獲得了3 個(gè)與脂肪功能相關(guān)的重要靶基因，為microRNA pulldown 技術(shù)在miRNAs 靶標(biāo)關(guān)系驗(yàn)證中的準(zhǔn)確度和高效性提供了一定的數(shù)據(jù)支撐。