張靜 熊燕 華永琳 郭玉 熊顯榮 字向東 李鍵

（1. 青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041）

不同部位骨骼肌代謝方式及功能存在較大差異，并且骨骼肌在運(yùn)動、損傷等生理病理?xiàng)l件下，根據(jù)不同的代謝和功能需求進(jìn)行持續(xù)的重塑［1］。對于家畜而言，不同的肌纖維類型組成，將影響家畜肉品質(zhì)。骨骼肌的這些差異主要是由于肌纖維類型的組成不同。因此，檢測骨骼肌纖維類型的組成對于研究骨骼肌的功能及家畜肉品質(zhì)顯得尤為重要。目前已經(jīng)使用多種標(biāo)準(zhǔn)對肌纖維進(jìn)行分型，包括組織化學(xué)方法［2］、收縮速度［3］、疲勞性、顯性酶途徑和肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MyHC 或Myh）亞型表達(dá)［4］。其中MyHC 亞型是肌纖維類型的分子標(biāo)記，檢測MyHC 亞型表達(dá)是最常用的分類標(biāo)準(zhǔn)。小鼠的肌肉纖維含有4 種MyHC 異構(gòu)體，分別為I 型（Myh7），IIA 型（Myh2），IIB（Myh4）型 和IIX 型（Myh1），單根肌纖維通常表達(dá)單個(gè)MyHC 異構(gòu)體［5-6］。其中I型纖維收縮速度慢，被稱為慢肌纖維，以氧化代謝產(chǎn)生能量。IIB 型和IIX 型纖維收縮速度快，被稱為快肌纖維，主要通過糖酵解途徑代謝葡萄糖。IIA 型纖維為中間型纖維，收縮速度快，屬于糖酵解/氧化磷酸化混合代謝類型［7］。近年來，為了從RNA水平研究肌肉組織肌纖維類型差異變化，闡明肌肉代謝和功能的分子機(jī)制，普遍采用靈敏度高，特異性好的逆轉(zhuǎn)錄熒光實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)。

使用RT-qPCR 方法檢測RNA 表達(dá)時(shí)，控制實(shí)驗(yàn)誤差至關(guān)重要。目前RT-qPCR 檢測技術(shù)以穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)閰⒄?，檢測基因的相對表達(dá)量，降低實(shí)驗(yàn)誤差對分析結(jié)果的影響［8］。然而，近年來研究表明常用管家基因肌動蛋白（Actb）和甘油醛-3-磷酸脫 氫 酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh）可能不適合作為所有基因檢測的內(nèi)參基因。已有文獻(xiàn)報(bào)道在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同時(shí)期［9］、子宮內(nèi)膜異位［10］和水牛心肝肌肉等20 種組織中［11］Gapdh和Actb均不是最佳內(nèi)參基因。在大鼠坐骨神經(jīng)粉碎模型中，以Actb作為內(nèi)參基因時(shí)，實(shí)驗(yàn)組靶基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，進(jìn)一步分析表明發(fā)生實(shí)質(zhì)變化是Actb而不是靶基因［12］。此外，越來越多的研究報(bào)道不同的組織、物種以及實(shí)驗(yàn)條件，穩(wěn)定的內(nèi)參基因具有特異性。例如，C57BL/10 小鼠股四頭肌中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留蛋白1（Retention in endoplasmic reticulum sorting receptor 1，Rer1）［13］。Hildyard 等［14］指 出，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1（Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，Hprt1）、琥珀酸脫氫酶亞基A（Succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A，Sdha）和核糖體蛋白L13a（Ribosomal protein L13a，Rpl13a）是犬股外側(cè)肌相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因。McBryan 等［15］用geNorm 法分析豬背最長肌中β2-微球蛋白（Beta-2-microglobulin，B2m）為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。綜上所述，盡管在某一肌肉中的穩(wěn)定內(nèi)參基因已有研究報(bào)道，但是不同物種、不同部位肌肉組織穩(wěn)定的內(nèi)參均存在差異?；赗TqPCR 技術(shù)的肌纖維分型是肌肉功能研究的重要手段，但迄今為止在肌纖維類型的研究中，穩(wěn)定的內(nèi)參基因尚不清楚。因此，有必要篩選肌纖維類型檢測的穩(wěn)定內(nèi)參基因。

本研究以小鼠肌纖維類型組成差異較大的腓腸?。℅astrocnemius muscle，GAS）、比目魚?。⊿oleus，SOL）、脛骨前肌（Tibialis anterior muscle，TA）和趾長伸?。‥xtensor digitorum longus，EDL）為試驗(yàn)材料，采 用RT-qPCR 技 術(shù)、geNorm［16］、NormFinder［17］、BestKeeper［18］和RefFinder［19］程序?qū)apdh、Actb、Rer1、Hprt1和肽基脯氨酰異構(gòu)酶A（Peptidylprolyl isomerase A，Ppia）、核糖體蛋白L7（Ribosomal protein L7，Rpl7）、B2m、Sdha和核糖體蛋白L27（Ribosomal protein L27，Rpl27）等9 個(gè)內(nèi)參基因在4種肌肉組織表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，旨在獲得小鼠骨骼肌纖維檢測的最佳內(nèi)參基因，為后續(xù)骨骼肌纖維類型定量檢測提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本試驗(yàn)所需實(shí)驗(yàn)鼠及小鼠標(biāo)準(zhǔn)化飼料均采購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，6 周齡雌性C57BL/6 小鼠5 只，自由采食，12 h 黑暗，12 h 光照，斷頸法處死小鼠，采集腓腸?。℅AS）、比目魚?。⊿OL）、脛骨前肌（TA）和趾長伸?。‥DL），將肌肉組織立即置于RNAiso Plus 中，使用眼科剪剪碎成每塊1 cm3左右，反復(fù)凍融2 次，破碎細(xì)胞，然后儲存于-80℃用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus（貨號D9109）、PrimeScript RT reagent 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ 貨號RR047A）、SYSR?Premix Ex TaqTMⅡ（ 貨號RR036A） 購自TaKaRa（ 美國）；一抗：Myh2 MyHC- ⅡA（ 貨 號2F7）、Myh4 MyHC- ⅡB（ 貨號10F5）和Myh7 MyHC-I（貨號BA-F8）均購自Developmental Studies Hybridoma Bank（美國）；二抗：Goat anti-Mouse IgG1，Alexa Fluor 568（ 貨 號A-21124）、Goat anti-Mouse IgM，Alexa Fluor 488（貨號A-21042） 和Goat anti-Mouse IgG2b，Alexa Fluor 488（貨號A-21141）均購自Thermo Fisher Scientific（美國）；山羊血清（貨號005-000-121）購自Jackson ImmunoResearch（美國）；Bovine serum albumin（BSA）（貨號700-105P）購自Gemini Bio（美國）；Triton X-100（貨號 X100）購自Sigma-Aldrich（美國）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取和cDNA 的合成 按照RNAiso Plus 試劑盒的使用說明提取腓腸肌（GAS）、比目魚肌（SOL）、脛骨前肌（TA）和趾長伸?。‥DL）的總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測RNA 樣品的核酸濃度及A260nm/A280nm值（該值在1.8-2.1 的樣品才可進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)）。使用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，以總RNA 為模板按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA 置于-20℃保存。

1.2.2 熒光定量RCR 引物設(shè)計(jì)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 本試驗(yàn)選取Gapdh、Actb、Rer1、Hprt1、Ppia、Rpl7、B2m、Sdha和Rpl27等9 個(gè)基因作為內(nèi)參基因，利用NCBI 中BLAST 軟件，根據(jù)GenBank 上9 個(gè)基因在小鼠中的基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR 引物引物（表1），由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成引物。將cDNA 模板按10 倍進(jìn)行稀釋，選取10-1-10-5稀釋倍數(shù)樣品進(jìn)行RT-qPCR，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR RT-qPCR 反應(yīng)體系為15 μL：SYSR?Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL，上游引物（10 μmol/L）1 uL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，cDNA 2 μL，補(bǔ)充ddH2O 至15 μL。反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s 共40 個(gè)循環(huán)。每種骨骼肌纖維組織樣品設(shè)置2 個(gè)重復(fù)。

表1 9 個(gè)候選內(nèi)參基因的引物序列

1.2.4 免疫熒光染色 實(shí)驗(yàn)方案參照Wang 等［20］，采用Leica-CM1850 冰凍切片機(jī)，OCT 包埋，溫度設(shè)定-20℃，切片厚度10 μm 制作冰凍切片，用封閉液（含5% 山羊血清、2% BSA 和0.2%的Triton X-100的PBS 溶液）室溫孵育樣品30 min。用封閉緩沖液稀釋一抗（Myh2、Myh4 和Myh7 抗體以1∶300的比例稀釋），4℃孵育過夜。PBS 洗5 次，每次5 min。用PBS 以1∶1 000 的比例稀釋二抗，室溫孵育50 min 后，PBS 洗5 次，每 次5 min。用mount medium 封片，避免氣泡的產(chǎn)生，并用指甲油封蓋玻片四周，防封片劑溢出并固定蓋坡片。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 熒光定量數(shù)據(jù)獲得自Bio-Rad CFX Manager 軟 件（Bio-Rad，F(xiàn)oster City，CA，USA），導(dǎo)出格式為Excel，使用5 軟件對該基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評估。Delta CT 法是根據(jù)ΔCT 的標(biāo)準(zhǔn)差的平均值對內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性排列；geNorm 和NormFinder 的分析均基于基因的相對表達(dá)量，即首先計(jì)算內(nèi)參基因的△CT（預(yù)評估基因的CT 值減去同一樣品中某一基因的最低CT 值），再根據(jù)公式2-△CT計(jì)算該基因的相對表達(dá)量，其中g(shù)eNorm 分析要求所有內(nèi)參照基因的M 值均低于1.5，具有最低M 值的基因具有最穩(wěn)定的表達(dá)；NormFinder 方法，穩(wěn)定性值越小變異系數(shù)越小，因此基因的表達(dá)穩(wěn)定性較高；BestKeeper 則根據(jù)計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)差（Std）、變異系數(shù)（CV）和相關(guān)系數(shù)（R）判斷穩(wěn)定性，其中R 值越大，Std 越小或者CV 值越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好；RefFinder 法是在4 種方法的基礎(chǔ)上使用幾何平均數(shù)算法計(jì)算穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性的檢測及標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

采集小鼠后肢骨骼肌組織（GAS、SOL、TA和EDL）提取總RNA，A260nm/A280nm的比值范圍為1.85-2.09，表明RNA 純度符合PCR 實(shí)驗(yàn)要求。對候選內(nèi)參引物進(jìn)行熒光PCR 實(shí)驗(yàn)，獲得擴(kuò)增及溶解曲線。如圖1 所示，溶解曲線均呈現(xiàn)單峰表明設(shè)計(jì)引物特異性較好。同時(shí)以樣品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，CT 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照E=10-1/Slope-1 計(jì)算擴(kuò)增效率（其中Slope 為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率）。經(jīng)10 倍稀釋得到的9 個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2），其線性關(guān)系良好，擴(kuò)增效率為94.4%-114.5%，R2決定系數(shù)為0.982 6-0.994 5，其均符合qPCR 實(shí)驗(yàn)對引物的要求。

2.2 內(nèi)參基因的循環(huán)閾值

在4 種骨骼肌中，通過RT-qPCR 分析獲得9 個(gè)候選內(nèi)參基因的循環(huán)閾值（CT）值（圖2）。結(jié)果顯示，9 個(gè)候選內(nèi)參基因的平均CT 值位于16-26 個(gè)循環(huán)之間，其中Hprt1循環(huán)閾值最高（26.63±0.86），Gapdh最低（16.28±0.36）。

2.3 內(nèi)參基因在骨骼肌中的表達(dá)穩(wěn)定性的評估

根據(jù)9 個(gè)候選內(nèi)參基因在不同部位骨骼肌的 循 環(huán) 閾 值，用Delta CT、geNorm、NormFinder、BestKeeper 和RefFinder 五種方法綜合評估9 個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性。如表3 和圖3 所示，以Delta CT 法 分 析 穩(wěn) 定 性 前3 個(gè) 基 因 為Rpl7＞Actb＞Rer1，以NormFinder 法分析穩(wěn)定性前3 個(gè)基因?yàn)镽pl7＞Rer1＞Actb，以BestKeeper 法分析穩(wěn)定性前3 個(gè)基因?yàn)镽pl7＞Gapdh＞Actb。盡管geNorm 法分析穩(wěn)定性前3 個(gè)基因?yàn)锳ctb＞B2m＞Rpl27，但以上3 種方法均得出在不同部位骨骼肌中Rpl7內(nèi)參基因最穩(wěn)定。為了綜合評價(jià)以上分析結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用RefFinder法計(jì)算上述4 種方法結(jié)果序列進(jìn)行的幾何平均數(shù)，顯示內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序?yàn)镽pl7＞Actb＞B2m＞Rer1＞Rpl27＞Gapdh＞Sdha＞Hprt1＞Ppia，且5 種方法中Ppia均為最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

2.4 穩(wěn)定內(nèi)參基因在肌纖維類型分型定量的驗(yàn)證

研究表明EDL 和SOL 分別是以快肌和慢肌纖維為主的骨骼肌，同時(shí)也是肌纖維類型研究的經(jīng)典骨骼肌［20］，本研究以EDL 和SOL 免疫熒光的肌纖維分型的結(jié)果為參照，驗(yàn)證上述篩選穩(wěn)定內(nèi)參Rpl7的可靠性。免疫熒光分型結(jié)果顯示SOL 中主要的肌纖維類型為I 型，所占比例約55%，其次為IIa（圖4-A，4-B），而EDL 中主要的肌纖維類型為IIB，所占比例約為60%，IIA 所占的比例較少，僅為10%左右（圖4-A，4-C），表明本研究采集樣本可靠。同時(shí)以最穩(wěn)定的Rpl7基因及最不穩(wěn)定的Ppia為內(nèi)參基因，對Type IIA（Myh2），IIB（Myh4） 和IIX（Myh1） 進(jìn)行qPCR 定量分析。然后計(jì)算免疫熒光及qPCR 檢測方法獲得IIA，IIB+IIX 肌纖維類型在EDL 和SOL肌肉中的比值，并對這兩種分析方法獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。通過免疫熒光方法檢測顯示SOL 中IIA 肌纖維類型約為EDL 中的2 倍，以Rpl7為內(nèi)參基因，qPCR 定量檢測SOL/EDL 的比值約為2.2，獲得的結(jié)果與上述免疫熒光的結(jié)果一致，而以Ppia的定量結(jié)果顯示IIA 肌纖維SOL/EDL 的比值約為1.2 倍（圖4-D）。同理，以Rpl7為內(nèi)參基因，IIB+IIX 肌纖維在EDL/SOL 的比值與免疫熒光一致，而Ppia為內(nèi)參基因的定量結(jié)果與免疫熒光分析方法差異較大（圖4-E）。因此，通過上述分析方法獲得的穩(wěn)定內(nèi)參可靠，可廣泛作為骨骼肌纖維類型分型的內(nèi)參基因。

圖1 骨骼肌中9 個(gè)管家基因的Real-time PCR 溶解曲線

表2 內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、決定系數(shù)R2 和擴(kuò)增效率

圖2 骨骼肌中9 個(gè)候選內(nèi)參基因的循環(huán)閾值

表3 九種候選內(nèi)參基因在小鼠骨骼肌組織中的表達(dá)穩(wěn)定性

圖3 九種候選內(nèi)參基因在小鼠骨骼肌組織中的表達(dá)穩(wěn)定性

圖4 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證

3 討論

RT-qPCR 是分析基因RNA 相對表達(dá)的首選方法［21-22］。即使是對于轉(zhuǎn)錄豐度較低的基因它也可以快速、準(zhǔn)確地實(shí)時(shí)分析基因表達(dá)模式［23］。而內(nèi)參基因的選擇對其結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。目前，研究者多采用Delta CT、geNorm、NormFinder、BestKeeper 中的一種或兩種評估穩(wěn)定地內(nèi)參基因。其中 Delta CT［24］根據(jù)基因表達(dá)差異的重復(fù)性對內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行排名，geNorm［18］根據(jù)內(nèi)參基因之間的平均配對變異V 值確定最穩(wěn)定的參考基因，并根據(jù)其表達(dá)穩(wěn)定性值（M）對基因進(jìn)行排序。而NormFinder［25］計(jì)算所有樣本中內(nèi)參基因表達(dá)的總體變化，以及組內(nèi)和組間的變化，根據(jù)內(nèi)參基因的穩(wěn)定值（SV）對其進(jìn)行排序，值越低表示基因表達(dá)穩(wěn)定性越高，反之亦然。BestKeeper［26］則根據(jù)內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）對內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行排名。本研究用上述4 種方法分別評估所測候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，同時(shí)采用RefFinder［19］計(jì)算每個(gè)候選內(nèi)參基因在上述4 種方法中的幾何平均值進(jìn)行綜合排名，提高了內(nèi)參基因穩(wěn)定性評估的可靠性。

盡管上述5 種運(yùn)算原理存在差異，導(dǎo)致內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序略有不同［27-28］，但本試驗(yàn)采用RefFinder 軟件綜合分析骨骼肌中較為適合的參考基因?yàn)镽pl7，最不穩(wěn)定的基因?yàn)镻pia。Rpl7是一種多功能核糖體蛋白，在翻譯控制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起作用［29-30］。已有研究報(bào)道Rpl7基因是在小鼠股四頭肌中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因［13］。Ppia是一種肽基脯氨酸異構(gòu)酶，催化寡肽中脯氨酸亞胺肽鍵的順反異構(gòu)化反應(yīng)［31］。與本研究結(jié)果一致，Gong 等［32］分析12 種內(nèi)參基因在能量限飼小鼠股四頭肌中最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Ppia。并且本研究以免疫熒光檢測肌纖維分型的數(shù)據(jù)為參照，驗(yàn)證了以表達(dá)最穩(wěn)定的Rpl7作為內(nèi)參基因，采用qPCR 檢測肌纖維類型組成的可靠性，表明Rpl7可廣泛的應(yīng)用于qPCR 檢測骨骼肌肌纖維分型的內(nèi)參基因。

近年來，研究者在不同實(shí)驗(yàn)條件下對某一特定部位骨骼肌的內(nèi)參基因進(jìn)行了篩選，這些特定部位的骨骼肌主要集中在股四頭肌和腓腸肌。研究表明高脂和高糖飼養(yǎng)小鼠腓腸肌穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)锳ctb＞Ywhaz9（色氨酸5-單加氧酶激活蛋白）＞Gapdh［33］。能量限制小鼠內(nèi)參基因在股四頭肌中穩(wěn)定性位于前三的為Gapdh＞Hprt＞Tubα（微管蛋白α）［32］。然而，在不同飼料硒水平飼養(yǎng)股四頭肌中Ppia和B2m較為穩(wěn)定［34］。已有研究報(bào)道不同部位骨骼肌，快慢肌纖維類型差異較大［35］。本研究選取EDL、SOL、TA 和GAS 四個(gè)部位的肌肉，其中EDL主要由快肌纖維組成，而SOL 主要由慢肌纖維組成，分別是機(jī)體內(nèi)典型的快骨骼肌和慢骨骼肌，因此用這些樣品篩選肌纖維類型分型的穩(wěn)定內(nèi)參基因，更具有代表性。并且本研究所篩選的穩(wěn)定內(nèi)參基因可用于不同部位骨骼肌的基因表達(dá)比較分析，但是否能適用于其他組織，需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究通過9 個(gè)常見內(nèi)參基因首次分析在快肌和慢肌纖維為主的骨骼肌的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明，Rpl7表達(dá)最穩(wěn)定，Ppia最不穩(wěn)定。Rpl7可作為出生后小鼠骨骼肌纖維類型檢測的穩(wěn)定內(nèi)參基因。