摘要：綜述了刺激隱核蟲感染誘發(fā)的免疫應答及其免疫預防的研究現(xiàn)狀，為開發(fā)阻斷或減少刺激隱核蟲感染的方法提供參考。研究顯示，刺激隱核蟲感染可以誘發(fā)宿主魚的先天性和適應性免疫;利用刺激隱核蟲的蟲體（特別是幼蟲）以及表面蛋白（或抑動抗原）的重組蛋白和真核表達的重組質粒DNA免疫宿主魚，均獲得了一定的相對免疫保護率（40%～100%）。今后應進一步研究魚與刺激隱核蟲之間的相互作用，以便綜合利用魚對刺激隱核蟲的免疫應答，研發(fā)高效、多元化的刺激隱核蟲病的防治方法。

關鍵詞：刺激隱核蟲;刺激隱核蟲病;免疫應答;免疫預防

中圖分類號：Q 95文獻標志碼：A文章編號：0253-2301（2021）02-0063-07

DOI： 1013651/jcnkifjnykj202102012

Research Progress on the Immunoprophylaxis of Cryptocaryon Irritans Infection

YU Lingying， HUANG Xiaohong*

（College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： The research status of the immune response induced by the infection of Cryptocaryon irritans and its immunoprophylaxis were reviewed， in order to provide reference for the development of methods to block or reduce the infection of Cryptocaryon irritans. The research showed that the infection of Cryptocaryon irritans could induce the innate and adaptive immunity of the host fish. The relative immune protection rate （40%-100%） was obtained by immunizing the host fish with the insect bodies of Cryptocaryon irritans （especially larvae）， the recombinant proteins of surface proteins （or immobilization antigens） and the recombinant plasmid DNA expressed in eukaryons. In the future， it is necessary to further study the interaction between fish and Cryptocaryon irritans， so as to comprehensively utilize the immune response of fish to Cryptocaryon irritans， and develop the efficient and diversified prevention and control methods of cryptocaryoniosis.

Key words： Cryptocaryon irritans; Cryptocaryoniosis; Immune response; Immunoprophylaxis

刺激隱核蟲Cryptocaryon irritans是寄生在海水硬骨魚身上的一種纖毛蟲類原生動物，其生活史包括4個階段：幼蟲期、滋養(yǎng)體期、包囊前體期、包囊期[1]。幼蟲在海水中游動以便尋找宿主。當遇到宿主時，幼蟲可通過魚軀干、鰓、鰭和眼等處表皮入侵宿主，并在魚體表皮與真皮之間轉化成滋養(yǎng)體。滋養(yǎng)體在魚皮組織中吸收營養(yǎng)，發(fā)育成熟后離開宿主，脫落到海水中形成了包囊前體。包囊前體在海水中緩慢游動，到達海底或容器底部時會黏附在上面逐漸形成包囊。隨后包囊開始不斷地分裂繁殖，最終產生高達200個左右幼蟲后，脫出包囊逸出到海水中繼續(xù)尋找新的宿主，開始下一個生活史循環(huán)。在26～28℃環(huán)境下，刺激隱核蟲以褐菖鲉Sebastiscus marmoratus作為宿主完成一個完整的生活史需要7～10 d的時間[2]。

被刺激隱核蟲感染后，宿主魚會表現(xiàn)出厭食、黏液分泌過多、在海水中沖撞、在網箱壁上摩擦止癢等異常行為，以及魚體被感染部位出現(xiàn)充血等癥狀。隨著蟲體發(fā)育，在魚體表、鰓、鰭和眼睛上會出現(xiàn)肉眼可見的白點，因此刺激隱核蟲病也被稱為“海水魚白點病”[3]。當鰓上的黏液過多，阻礙了魚的呼吸作用、水循環(huán)以及有害物質的排出，就會導致魚的死亡。當宿主魚感染嚴重的時候，免疫因子的釋放受到抑制、器官組織功能紊亂從而導致免疫力的下降[4]。刺激隱核蟲病還易繼發(fā)細菌感染、炎癥發(fā)生，如鰓表皮細胞的腫脹、增生，以及寄生蟲接觸區(qū)域的壞死脫落。

刺激隱核蟲對于熱帶和亞熱帶海水硬骨魚來說是一個主要的威脅[3]。由于野生環(huán)境中的魚類密度通常較低，刺激隱核蟲感染不易流行，因此危害不大。但是該蟲很容易在高密度的海水養(yǎng)殖魚中暴發(fā)感染，導致高死亡率，對海水魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失[5]。在福建省寧德市大黃魚主產區(qū)，每年發(fā)病率達80%以上，經濟損失約2億元[6]。2008年，農業(yè)部將刺激隱核蟲病認定為二級動物傳染病。

近年來，學者們針對刺激隱核蟲病的防治開展了許多研究。物理方法如間斷性淡水處理、及時移除脫落到水族箱底的包囊等[7]，具有安全性較高、環(huán)境友好的特點，但是防治效果較弱，且在大水體中不易操作。Yin等[8]研究發(fā)現(xiàn)銅合金可以使刺激隱核蟲包囊前體的細胞膜破裂、原生質溢出，經銅板處理后的刺激隱核蟲細胞的酶活力顯著降低，因此銅合金板可以有效地阻斷刺激隱核蟲生活史，是潛在的防治刺激隱核蟲病的材料。常用的防治刺激隱核蟲病的傳統(tǒng)化學藥物甲醛、孔雀石綠、次甲基蘭、鹽酸奎寧、硫酸銅、乙酸、雙氧水、次氯酸鈉、鹽霉素、磺胺類抗生素等對刺激隱核蟲都具有一定的殺傷效果[9-11]，但對宿主具有毒性且易造成藥物殘留、使細菌產生耐藥性、易污染環(huán)境，并且孔雀石綠等藥物已被政府明令禁止使用。我國中藥文化有著數(shù)千年的悠久歷史，近年來有學者研究辣椒、生姜、檳榔、復方中草藥以及植物中的葉酸等對刺激隱核蟲病防治效果[12-14]，發(fā)現(xiàn)它們對殺滅刺激隱核蟲幼蟲具有較好的效果，但難以殺滅包囊。因此，中草藥療法僅適用于刺激隱核蟲形成包囊前的防治。

此外，許多學者以免疫預防為出發(fā)點嘗試尋找防治刺激隱核蟲病的突破口。已有的研究主要是以幼蟲及刺激隱核蟲表面膜蛋白為抗原免疫宿主魚，證明了受免魚能夠產生特異性抗體，該抗體對幼蟲具有阻動效應[15-17]，一定程度上為刺激隱核蟲病的免疫預防方法研究提供了理論依據(jù)。然而至今研究工作者還未能找到真正有效的預防、控制和治療該病的方法。本文綜述了當前魚類對刺激隱核蟲感染的免疫應答及刺激隱核蟲病的免疫預防研究進展情況，旨在為相關研究者了解硬骨魚類感染刺激隱核蟲的發(fā)病機理、篩選高效的免疫抗原及研發(fā)有效的治療藥物和疫苗提供參考。

1海水魚對刺激隱核蟲的先天性免疫應答

余玲瑩等：刺激隱核蟲感染的免疫預防研究進展2021年第2期2021年第2期余玲瑩等：刺激隱核蟲感染的免疫預防研究進展11Toll樣受體信號通路

海水硬骨魚對刺激隱核蟲的感染會產生先天性免疫和特異性免疫反應[18]。先天性免疫系統(tǒng)主要由模式識別受體（PRRs）介導，可以特異性識別保守區(qū)域原相關分子模式（PAMPs）。在特異性免疫作出反應之前，先天性免疫在抗擊病原體中占據(jù)了重要的作用。在硬骨魚中主要有4種類型的模式識別受體，即Toll樣受體（Tolllike receptors）、C型凝集素受體（Ctype lectin receptors）、NOD樣受體（NODlike receptors）和RIGI 樣受體（RIGIlike receptors）[19]。有研究表明，刺激隱核蟲感染魚宿主后，TRL的家族成員直接或間接地與PAMPs結合，隨后與下游的Toll白介素1受體結構域（Tollinterleukin 1 receptor domain，TIR）相互作用，激活NFκB、MAPKs和IRFs等轉錄因子來誘導促炎因子和干擾素的表達，從而引發(fā)先天性免疫的發(fā)生[20]。

TLR2、MyD88和IL1β在TLR通路中充當信號導入、傳導和信號導出的功能，斜帶石斑魚Epinephelus coioides被刺激隱核蟲感染后，其感染部位和免疫器官中的TLR2、MyD88和IL1β表達量均上調;脾臟中TLR3的表達量在感染6 h 時顯著上調并達到峰值，與TLR信號轉導通路相關的基因EcMal和EcTRAF5同樣在感染部位（鰓）和免疫器官（頭、腎）中的表達量上調，說明TLR信號通路在宿主抗刺激隱核蟲過程中占據(jù)了重要的作用[21]。而大黃魚Larimichthys crocea在感染刺激隱核蟲后，TLR5的表達量增加了111倍，其很可能參與到宿主識別抗原組分提高防御病原的作用，并且其表達水平可能與宿主感染寄生蟲后的存活時間有關[22-23]。在先天性免疫中，這些信號傳送到局部感染位置形成了炎癥反應。

12趨化因子和細胞因子信號通路

在早期感染階段，炎癥反應在抗病原蟲機制中占據(jù)了重要的作用。在被刺激隱核蟲感染的大黃魚肝臟轉錄組中，TNFα、IL1β、IL6、IFNα 和 IFNβ等促炎細胞因子以及CXCL10/12 和CCL19/20/25等趨化因子的表達量升高，促進炎癥反應的發(fā)生;其他因子如TAK1、PIK3Ch和PIK3R等則可能為了避免炎癥反應過度進行了負反饋調節(jié)[22]。斜帶石斑魚皮膚中的趨化因子CCL1、CCL4和CXCL911在感染后表達量上調，同時皮膚相關淋巴組織（SALT）召集了各類免疫細胞，免疫細胞迅速地遷移集中到感染部位形成一個局部免疫防御[24]。此外，在受染石斑魚的鰓上有檢測到大量非特異性免疫細胞，例如嗜酸性白細胞、中性粒白細胞、巨噬細胞[25]。作為最重要的吞噬細胞類型，中性粒細胞通過依賴氧的殺傷機制利用NADPH產生大量的活性氧ROS，氧化殺死大量的病原體，并且發(fā)現(xiàn)在感染部位免疫相關基因的表達要早于免疫器官相關基因的表達，說明當感染發(fā)生時，大量的吞噬細胞聚集在了感染部位，激活生物合成能力，觸發(fā)了更強的免疫應答。隨后吞噬細胞釋放免疫因子，導致了炎癥和免疫應答的發(fā)生，并進一步激活免疫器官的效應細胞，使得相關基因表達量增加[26]。

在先天性免疫的后期階段主要由細胞因子和趨化因子驅動引起急性期反應（the acute phase response， APR）[27]。其中，細胞因子IL1β被認為是硬骨魚中炎癥免疫應答中最重要的調節(jié)因子，在抗刺激隱核蟲的過程中具有重要作用。比如，感染刺激隱核蟲后斜帶石斑魚Ecoioides的皮膚及卵形鯧鲹Tovatus的主要免疫器官腎臟、脾臟、肝臟、鰓和皮膚中的IL1β的表達量會顯著增加[28]。此外，IL8、IL11、 IL34等細胞因子也參與到抗蟲過程中[29-30]。虹鱒魚Oncorhynchus mykiss皮膚中IL8的表達量在感染后第3 d顯著增加，并且中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞遷移到感染的部位并增殖，說明細胞免疫在感染72 h后被激活并對刺激隱核蟲產生抵御作用[24， 30]。細胞因子和細胞因子受體交互作用通路貫穿整個刺激隱核蟲感染過程，但細胞因子在抗蟲過程中的具體功能仍有待進一步研究。

13抗菌多肽和替代補體途徑

抗菌多肽 （AMPs）是先天性免疫的重要組分之一，是由宿主產生的多肽或者小分子蛋白，幾乎存在于所有的生物體中，這些分子擁有強大的廣譜抗菌活性，在防御病原體入侵宿主中占有重要的作用。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)，在海洋生物的皮膚、鰓和腸道等表皮上擁有豐富的抗菌多肽，可以作為第一道防線防止病原微生物的入侵。大黃魚Lcrocea肝臟的轉錄組表明，在刺激隱核蟲感染過程中，AMPs家族中的Hepcidin、hepcidinlike、piscidin5like、piscidin5like type4 和BPI（Bactericidal permeability increasing protein）的表達量均上調以便大黃魚防御刺激隱核蟲的感染[31]。由此可見，抗菌多肽在刺激隱核蟲的入侵宿主的過程中具有防御作用?；煅|（Morone chrysops×Morone saxatilis） MCs中分離的Piscidin 2，使用劑量高于125 μg·mL-1時可以使刺激隱核蟲幼蟲出現(xiàn)腫脹、膜破裂、內容物溢出等現(xiàn)象[32]，說明piscidins作為AMPs家族最普遍的成員之一，具有很強的抗刺激隱核蟲的活性。刺激隱核蟲感染后，大黃魚Lcrocea的Piscidinlike（LcPis）和piscidin 5like（LcP5L）表達上調并且對刺激隱核蟲有致命作用，可以讓其幼蟲行動減緩、纖毛分開、細胞變形，使得幼蟲和滋養(yǎng)體細胞膜破裂，胞質溢出[33-35]。因此，piscidins抗刺激隱核蟲的作用機制值得進一步研究。

補體系統(tǒng)是由35種胞質溶解蛋白組成，在先天性免疫和適應性免疫中占據(jù)了重要的作用。有研究表明在應對刺激隱核蟲感染的早期，魚類主要通過激活替代補體途徑（the alternative pathway，AP），當沒有抗原抗體復合物形成的情況下，魚的有機體缺乏C1、C2和C4，外源入侵物質直接激活C3，激活非特異性免疫AP途徑[36]。Wang等[22]通過大黃魚肝臟轉錄組證實了激活AP途徑的FH和C3樣基因在刺激隱核蟲感染后表達量會顯著上調。Dan等[37]也說明了刺激隱核蟲感染可以調節(jié)斜帶石斑魚Ecoioides血液中的AP途徑。在受染的銅鑼魚Nalbiflora中，F(xiàn)I、FH、FB和CD59等AP補體途徑相關基因表達顯著上調，而經典補體途徑和凝集素補體途徑相關基因的表達沒有很大差別[38]。

2宿主對刺激隱核蟲的適應性免疫應答

Yoshinaga等[39]發(fā)現(xiàn)刺激隱核蟲免疫底鳉Fundulus heteroclitus sp后會產生免疫血清抗體。Luo等[15]發(fā)現(xiàn)對斜帶石斑魚Ecoioides進行腹腔注射和表面感染刺激隱核蟲可以產生適應性免疫應答。適應性免疫應答主要通過B淋巴細胞和T淋巴細胞進行。目前為止，硬骨魚類主要有3種由B細胞分泌的免疫球蛋白，即IgM、IgD和IgT/IgZ，其中IgM在硬骨魚中的分布最為廣泛[40-41]。T細胞主要有2種，為細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells）和輔助性T細胞（helper T cells）。細胞毒性T細胞可以直接殺死被感染的細胞，輔助性T細胞主要通過分泌細胞因子來調節(jié)其他細胞。

斜帶石斑魚Ecoioides皮膚轉錄組分析發(fā)現(xiàn)：感染刺激隱核蟲后，T細胞標志物CD4和CD48、B細胞標志物 CD22和CD81 以及B 細胞受體激酶Lyn的表達量上調，說明在皮膚感染部位T/B 細胞的存在且進行了擴增，此時適應性免疫應答發(fā)揮了作用[24]。研究還發(fā)現(xiàn)，注射過抗刺激隱核蟲DNA疫苗的斜帶石斑魚Ecoioides脾臟中細胞免疫應答和體液免疫應答均被激活，MHCII、MHCI、CD4+、CD8α+、IFNγ、TNFα、IL12、IgM 重鏈和IgT重鏈的表達量均上調[42]，說明了免疫防治刺激隱核蟲病是有效可行的，可以通過疫苗注射讓宿主產生獲得性免疫來防御刺激隱核蟲的感染。在刺激隱核蟲感染銅羅魚Nalbiflora后期，CD34、IgM、IgD、IGH 和PIGR的表達量上調，CCR9、GZMB和IGH的表達量下調，在mRNA 水平說明了獲得性免疫主要發(fā)生在感染后期[38]。因此，在免疫防治的過程中，不僅可通過疫苗來提高宿主的適應性免疫應答，同時在日常的養(yǎng)殖過程中還要保證宿主魚的健康，提高它們的免疫力，發(fā)揮先天性免疫應答與適應性免疫應答的協(xié)同作用，達到有效防治刺激隱核蟲病的目的。

3宿主對刺激隱核蟲的皮膚黏膜免疫應答

硬骨魚類的皮膚中含粘膜相關淋巴組織，不僅參與生理屏障作用，還可以產生先天性和適應性免疫應答。有研究表明，未被感染的銅羅魚Nalbiflora的皮膚黏液可以殺死刺激隱核蟲[38]，說明了銅羅魚Nalbiflora的皮膚黏液中含有一些天然活性成分可以防御刺激隱核蟲的感染。斜帶石斑魚Ecoioides感染和未感染的皮膚組織的轉錄組分析亦表明，一些免疫因子、趨化因子和趨化因子受體、TLR和Lyn都有顯著的基因表達差異，說明了皮膚黏膜在對抗刺激隱核蟲的感染過程中發(fā)生了免疫應答[43]。有報道認為，刺激隱核蟲感染后，ILs在鰓中具有很高的表達量，可能因為鰓在感染過程中首先遭到病原攻擊[44-45]，免疫因子迅速集中到感染部位誘發(fā)免疫應答。據(jù)此可以認為，在感染的早期階段皮膚黏膜免疫應答在局部感染位置占據(jù)主要防御作用，同時某些海水硬骨魚的皮膚黏膜中含有抗刺激隱核蟲物質[38]，因此可以通過研究相關海水硬骨魚的皮膚黏膜，找到抗刺激隱核蟲的有效成分，從而應用于刺激隱核蟲病的防治工作中。

4刺激隱核蟲病的免疫防治

綜上所述，刺激隱核蟲感染誘發(fā)了魚類宿主的先天性和適應性免疫反應。利用刺激隱核蟲蟲體為抗原，可使魚類宿主對刺激隱核蟲（特別是幼蟲）的再次感染產生免疫保護作用，最高可達到100%的相對存活率（RPS）[46]，為刺激隱核蟲的免疫保護方法的研究帶來了希望。

41以刺激隱核蟲表面蛋白為抗原的疫苗研究

寄生蟲的表面膜蛋白與宿主直接接觸，常被認為是主要的免疫顯性抗原，是潛在的疫苗候選分子[47]。因此研究者也克隆了多種刺激隱核蟲的表面膜蛋白，由于這些表面膜蛋白的免疫血清對刺激隱核蟲幼蟲具有較好的阻動效果，也將它們稱為抑動抗原（immobilization antigens，即Iantigen）。將這些表面蛋白作為抗原腹腔注射魚體，可以使魚類表達免疫相關基因，防御刺激隱核蟲的感染。Hatanaka等[17]發(fā)現(xiàn)了幼蟲和滋養(yǎng)體上的表面抗原（CISA32）;Lin等[48]從滋養(yǎng)體的cDNA文庫中篩選了多種表面膜蛋白，利用大腸桿菌表達了刺激隱核蟲表面蛋白的重組蛋白（rCiSA326），將它們作為抗原免疫小鼠后獲得的鼠血清對刺激隱核蟲幼蟲具有較好的阻動效果。Mo等[49]通過刺激隱核蟲的比較轉錄組分析發(fā)現(xiàn)了9種可能的表面抗原基因，為刺激隱核蟲疫苗的制備提供了更多的可能。

同時，還有學者利用表達刺激隱核蟲表面蛋白基因的真核表達質粒DNA作為抗原，也達到了不錯的成效。Jose等[50]構建了DNA疫苗pcDNA31optiAg，肌肉注射后提高了宿主46%的相對存活率（RPS）。將iAg與刺激隱核蟲Hsp70 C端區(qū)分別連到pcDNA31表達載體上共同免疫石斑魚，在第20 d和第32 d利用刺激隱核蟲進行攻毒可達到100%的相對存活率（RPS），免疫后49 d仍達到51%RPS防護能力[42]。

42以刺激隱核蟲細胞骨架蛋白、蛋白酶為靶標的疫苗研究

細胞骨架的動態(tài)變化在原蟲生長發(fā)育、入侵宿主過程以及成囊和脫囊等各種生理活動中起了重要的作用。刺激隱核蟲的寄生階段-滋養(yǎng)體是通過攝取寄生部位的組織碎片和組織液為生，因此猜測抗體也可隨著滋養(yǎng)體的攝食進入細胞內。Huang等[51]從刺激隱核蟲cDNA文庫中篩選了肌動蛋白（CiActin）、肌動蛋白解聚因子（CiADF）、組裝抑制蛋白（CiProfilin）等細胞骨架蛋白相關基因并進行了重組表達，評估重組蛋白對宿主的免疫保護效果;目前已報道了分別被重組的肌動蛋白解聚因子（CiADF2）和1433蛋白免疫后的鼠血清能夠抑制刺激隱核蟲幼蟲的活性。

除此之外，蛋白酶在原蟲的發(fā)育和感染的過程中占據(jù)著重要的作用。通過刺激隱核蟲的轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，在滋養(yǎng)體階段，絲氨酸和半胱氨酸的蛋白酶具有很高的表達量，在122種的蛋白酶中有82種為半胱氨酸蛋白酶[49]。Watanabe等[52]通過在培養(yǎng)刺激隱核蟲幼蟲的介質中加入絲氨酸和半胱氨酸的蛋白酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)刺激隱核蟲發(fā)育、感染和入侵宿主的生命過程受到阻礙。進一步證實了這兩種蛋白酶在刺激隱核蟲的生長發(fā)育、感染和入侵宿主中擁有重要的作用，可以將其作為防治原蟲的藥物和疫苗潛在的靶向目標。雖然滋養(yǎng)體時期蛋白酶的詳細信息有助于刺激隱核蟲病防治方法的研發(fā)，但是相關蛋白酶的特性仍不夠明確，還有待于進一步研究。

5展望

目前，許多學者在魚對刺激隱核蟲感染的免疫應答及刺激隱核蟲病的免疫防治方面做了大量工作，也獲得了一些成果。然而由于無法對刺激隱核蟲進行實驗室保種，傳代的過程中也經常遇到困難，使得魚與刺激隱核蟲之間相互關系的研究進展緩慢。因此，為了找到高效安全的刺激隱核蟲病的防治方法，未來還應從以下幾個方面繼續(xù)努力。（1）加深對刺激隱核蟲發(fā)育規(guī)律、生活史不同時期特點的了解，以期找到刺激隱核蟲的實驗室保種方法，建立簡單、可操作性強的大規(guī)模培養(yǎng)刺激隱核蟲的方法，為制備幼蟲滅活疫苗、實驗室魚與刺激隱核蟲之間相互關系等研究奠定基礎。（2）進一步開展海水魚對刺激隱核蟲感染的免疫應答機制研究。建議通過構建實驗室模式動物，利用轉錄組學、蛋白質組學等生物學方法，從更深層次了解宿主魚感染刺激隱核蟲后的免疫應答及其機制，為疫苗研究奠定理論基礎。（3）在深入了解刺激隱核蟲生物學的基礎上，開展多元化的疫苗研究，并將具有一定免疫效果的疫苗盡快應用到實際生產中，以驗證其免疫效果。同時應將物理、化學和免疫預防手段相結合，建立一套切實可行高效的綜合防治系統(tǒng)，以期早日解決刺激隱核蟲病帶來的問題。

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（責任編輯：柯文輝）

余玲瑩，黃曉紅刺激隱核蟲感染的免疫預防研究進展＼[J＼]福建農業(yè)科技，2021，51（2）：63-69.

收稿日期：2020-12-26

作者簡介：余玲瑩，女，1995年生，在讀碩士，主要從事發(fā)育生物學研究。

*通信作者： 黃曉紅， 女，1963年生，教授，主要從事疾病的遺傳與分子機制研究（Email：biohxh@fjnueducn）。

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31672244）。