（重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，401331）

1 引言

蜜蜂在維持自然生態(tài)平衡和生態(tài)農(nóng)業(yè)，供給人類高營(yíng)養(yǎng)和保健功能蜂產(chǎn)品的過程中扮演重要角色[1]。中華蜜蜂（Apis cerana cerana）是我國(guó)獨(dú)特的蜜蜂資源，具有極強(qiáng)的耐寒性和抗螨性，因此中蜂對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及花卉植物的冬季繁殖具有不可替代的作用。但近十年來，由于各種原因，世界各地的蜜蜂大量流失，嚴(yán)重威脅各國(guó)的養(yǎng)蜂業(yè)、生態(tài)平衡和農(nóng)村農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[2]。然而我國(guó)中華蜜蜂生存所受到的主要威脅則是中蜂囊狀幼蟲病，如何減少蜂群的流失已成為各國(guó)政府和科學(xué)家面臨的重要課題[3]。

蜜蜂囊狀幼蟲病病毒（SBV）是一類正鏈單股昆蟲RNA 病毒，被劃入傳性軟腐病毒科（Iflavirus）、腸道病毒屬（EV）。該病毒基因組除去Poly A尾約有8832個(gè)堿基，有一個(gè)較大編碼框（ORF），其編碼約有2860個(gè)氨基酸殘基的Polyprotein[4]。在病毒自身編碼的蛋白酶的作用下，Polyprotein的-NH2末端被剪切后加工產(chǎn)生成熟的結(jié)構(gòu)蛋白，-COOH端剪切后加工產(chǎn)生為非結(jié)構(gòu)蛋白。感染SBV的A.cerana.cerana所攜帶的病原稱中蜂囊狀幼蟲病毒，SBV最早是在西方蜜蜂患病幼蟲（Apis mellifera）中報(bào)道，但對(duì)東方蜜蜂（Apis cerana,Fabricius）（包括A.cerana cerana）的危害更為嚴(yán)重[5]。其主要感染蜜蜂的幼蟲，使其不完全蛹化且蛹內(nèi)充滿病毒粒子[6]。當(dāng)損害嚴(yán)重時(shí)，大量幼蟲會(huì)因感染而死亡，同時(shí)成蟲為維護(hù)蜂群的生存環(huán)境而清理病死的幼蟲，在清理過程中被感染SBV的成蟲雖無癥狀，但活動(dòng)能力下降以致種群優(yōu)勢(shì)減弱，最終導(dǎo)致種群的滅絕[7]。據(jù)報(bào)道，SBV先后對(duì)泰國(guó)、韓國(guó)、日本和中國(guó)的A.cerana種群及養(yǎng)蜂產(chǎn)業(yè)形成無法挽回的損失[8-14]，目前A.cerana cerana蜂群囊狀幼蟲病的發(fā)病率仍在50%～70%[15]。

本文主要介紹CSBV檢測(cè)方面的研究成果，以期為我國(guó)中蜂囊狀幼蟲病的診斷、預(yù)防和檢疫以及蜂產(chǎn)品病原菌污染的檢測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)思路。

2 臨床診斷方法

臨床診斷方法只適用于已感染SBV的幼蟲并致幼蟲發(fā)病的蜂群，其癥狀表現(xiàn)為蜂箱外側(cè)發(fā)現(xiàn)明顯的病死幼蟲，同時(shí)可觀察到巢脾內(nèi)部死亡幼蟲逐一被清潔蜂拖出巢房；患病蜂群的巢脾出現(xiàn)明顯的“插花子脾”現(xiàn)象[16]，同一巢脾且尚未封蓋巢房?jī)?nèi)的幼蟲皮下滲出液增多，從患病到死亡體表顏色由白色逐漸變?yōu)闇\黃色，最后變?yōu)樽睾稚?；病死幼蟲水分蒸發(fā)后，用鑷子夾起會(huì)呈現(xiàn)小囊狀或袋狀外觀[17]。然而，臨床診斷法適用于幼蟲發(fā)病的蜂群而成年蜜蜂感染病毒之后沒有明顯癥狀，故此法不適用于蜂群隱形感染的情形。

3 電子顯微鏡檢測(cè)方法

電子顯微鏡檢測(cè)法是較為常見的檢測(cè)蜜蜂囊狀幼蟲病毒的手段。楊冠煌以及馮建勛等[18,19]對(duì)CSBV提純后，制備高濃度、高純度的CSBV，再借助電子顯微鏡對(duì)CSBV進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)CSBV粒子直徑大約26～30nm的球狀病毒粒子。該法操作簡(jiǎn)單，但實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求高。

4 PCR檢測(cè)方法

隨著基因組生物學(xué)的快速發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）日益成熟。PCR是一類特定基因或克隆序列的體外酶促擴(kuò)增技術(shù)。近幾年來自世界各地的研究人員也對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，目前已有10余種不同類型的PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的PCR相結(jié)合的技術(shù)。該技術(shù)目前是鑒定CSBV最常用的方法，RT-PCR技術(shù)因其高靈敏度可檢測(cè)出極低拷貝數(shù)的RNA樣本。根據(jù)NCBI上已發(fā)布的CSBV序列，研究人員可設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物，從疑似受感染蜂群中擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)條帶，若擴(kuò)增出條帶所測(cè)得序列與CSBV序列一致，則可確診疑似蜂群感染CSBV。截至目前，已有多名研究人員利用該方法檢測(cè)CSBV。李明等[20]利用GenBank上已發(fā)布的CSBV基因組設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)出遼寧地區(qū)的蜜蜂存在CSBV病毒，并將遼寧地區(qū)的CSBV部分基因序列與廣東的CSBV基因序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)遼寧的CSBV與廣東的CSBV基因序列對(duì)應(yīng)區(qū)段具有94%的同源性。沈克飛等[16]選取CSBV基因組序列中的RNA依賴的RNA聚合酶基因序列，開發(fā)了CSBV半套式RT-PCR檢測(cè)方法，且特異性較高。周亮等[4]根據(jù)SBV全序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)出該病毒，并將部分基因序列片段與廣東的SBV序列進(jìn)行比對(duì)，兩者同源性高達(dá)96.8%。沈克飛等[21]使用SB14F/SB15R引物運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了重慶、浙江和云南地區(qū)蜜蜂幼蟲中SBV的感染率，表明SBV在不同地區(qū)對(duì)蜜蜂種群的危害程度不同，在重慶地區(qū)中華蜜蜂呈流行趨勢(shì)，而浙江中華蜜蜂、云南西方蜜蜂呈低感染狀態(tài)。曹蘭等[15]使用SB14F/SB15R[22]引物擴(kuò)增RdRp基因序列，利用該基因片段對(duì)SBV進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增片段序列與CSBV序列同源性高于95%，與SBV同源性高于89%。該病毒主要分為歐洲型、遠(yuǎn)東型和南非型3個(gè)基因型，揭示SBV總體上按地域分型。Kerstin Wernike等[23]第一次利用TaqMan MGB探針qRT-PCR的方法對(duì)SBV進(jìn)行了檢測(cè)和定量。宋戰(zhàn)昀等[24]針對(duì)SBV保守區(qū)設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物和一條探針，開發(fā)了快速檢測(cè)SBV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法，可對(duì)低病毒含量的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)和蜜蜂制品中蜜蜂囊狀幼蟲病毒污染的檢測(cè)。馬鳴瀟等[25]也采用TaqMan PCR檢測(cè)了CSBV，同樣表明TaqMan PCR具有較高的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。根據(jù)上述研究人員的工作，本文匯總了RT-PCR技術(shù)檢測(cè)靶標(biāo)、引物及反應(yīng)條件（表1）。

表1 RT-PCR引物及條件

4.1 Nested-PCR技術(shù)

巢式PCR（Nest-PCR）是一種異化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，且在該病感染早期可快速檢測(cè)SBV。Nested-PCR技術(shù)的兩對(duì)特異性引物分別對(duì)靶片段進(jìn)行擴(kuò)增而獲得目的產(chǎn)物，該檢測(cè)技術(shù)極大降低了非特異性擴(kuò)增的幾率。許益鵬等[26]根據(jù)病毒保守區(qū)設(shè)計(jì)套式引物（表2），通過RT-PCR結(jié)合Nest-PCR的方法擴(kuò)增病毒的特征核苷酸區(qū)域，將擴(kuò)增產(chǎn)物序列與該病毒已公布的其他序列進(jìn)行比對(duì)，表明該段序列和我國(guó)廣東遞交的SBV序列的對(duì)應(yīng)區(qū)段有90%～95%的同源性；而在氨基酸水平上有97%～98%的同源性。序列分析也表明，不同的地理種群蜜蜂囊狀幼蟲病毒基因組序列都有所不同。在實(shí)際應(yīng)用中，常用外嵌套引物（F1+R1）和內(nèi)嵌套引物（F2+R2）做2個(gè)反應(yīng)即足以判斷。

表2 巢式PCR引物及條件

表3 RT-PCR及梯度條帶PCR引物

4.2 PCR技術(shù)

梯度PCR技術(shù)可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)不同退火溫度的擴(kuò)增反應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化并確定特定體系相應(yīng)的最優(yōu)退火溫度。劉新宇等[27]根據(jù)GenBank中已知的CSBV序列，針對(duì)CSBV分別設(shè)計(jì)了用于傳統(tǒng)RT-PCR技術(shù)的4對(duì)特異性引物和用于梯度條帶RTPCR技術(shù)的5對(duì)特異性引物（表3）。利用兩種技術(shù)分別對(duì)陜西南部、陜西北部及關(guān)中的健康蜂群和CSBV感染蜂群進(jìn)行染病鑒定，表明針對(duì)陜西三個(gè)地區(qū)檢測(cè)，傳統(tǒng)RT-PCR技術(shù)和梯度條帶RT-PCR技術(shù)鑒定結(jié)果相同，且與已知序列CSBV的同源性在93%～96%之間。但與傳統(tǒng)的RT-PCR鑒定方法相比，梯度條帶PCR方法獲得結(jié)果直觀、鑒定費(fèi)用少、檢測(cè)效率高。梯度條帶PCR技術(shù)在電泳檢測(cè)階段即可通過DNA片段的梯度次序確定是否存在病毒，從而加快了病毒在宿主體內(nèi)的檢測(cè)周期。

4.3 多重引物PCR

多重引物PCR又稱復(fù)合PCR，在同一PCR反應(yīng)體系中加上多種病原微生物的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可同時(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定出是特異型病原體感染。林麗花等[28]根據(jù)GenBank的CSBV全基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物（表4），采用二重PCR對(duì)同時(shí)感染CSBV和N.ceranae的樣本進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，二重PCR擴(kuò)增序列與已知兩物種序列的同源性均在92%～96%，與單一PCR具有相近的靈敏度和精度。

4.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），是一類適用基因診斷的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。主要是針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)特異引物[29]，在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，在60℃～65℃恒溫?cái)U(kuò)增，較短時(shí)間即可實(shí)現(xiàn)109～1010倍的擴(kuò)增倍數(shù)，該技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備要求低，水浴鍋或恒溫箱就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，而且操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物易檢測(cè)。Smet等[30]基于MLPA技術(shù)建立了蜜蜂醫(yī)生（BeeDoctor）多功能診斷工具，可同時(shí)檢測(cè)10種蜜蜂病毒。楊金龍等[31]采用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)RT-LAMP檢測(cè)東方蜜蜂囊狀幼蟲病毒，表明65℃水浴20min就能檢測(cè)到SBV，并且由于擴(kuò)增核酸濃度的增加可引起顏色變化，肉眼即可看到陽性擴(kuò)增反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。馬鳴瀟等[29]比較了LAMP和聚合酶PCR方法在31種病蜂樣品中的檢測(cè)效率，LAMP方法的檢測(cè)限為1pg。王向輝[32]等根據(jù)SBV-UK株多聚蛋白基因序列，選保守區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，通過LAMP real-time Turbidimeter儀對(duì)SBV的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行檢測(cè)和實(shí)時(shí)監(jiān)控。表明，在63℃恒溫?cái)U(kuò)增40min后，其特異性與常規(guī)PCR檢測(cè)SBV一致；LAMP體系檢測(cè)最低濃度為32拷貝/μl；提取的SBV核酸進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，顯示最大擴(kuò)增速率的重復(fù)率均小于10%，表明LAMP檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性（表5）。

表4 多重引物PCR引物及條件

表5 LAMP-PCR引物

4.5 基因芯片技術(shù)

2006年10月26日，美國(guó)蜜蜂基因測(cè)序聯(lián)盟（HGSC），在《Nature》雜志上公布了意大利蜜蜂基因組的測(cè)序結(jié)果[33]，同時(shí)，由Robinson等研制的西方蜜蜂頭部cDNA芯片和全基因組寡核苷酸芯片相繼問世[34]，從此標(biāo)志著蜜蜂研究進(jìn)入后基因組時(shí)代[35]。Glover等[36]利用寡核苷酸微列陣芯片技術(shù)同時(shí)檢測(cè)了西方蜜蜂感染的9種病毒。寡核苷酸微陣列技術(shù)已被證明可檢測(cè)一系列宿主中的多種病原體[37,38]。楊喻曉[39]等利用基因芯片在分子水平上研究中華蜜蜂的抗螨機(jī)理，對(duì)加快養(yǎng)蜂品種選育，尋找新基因、疾病診斷、藥物篩選等均具有重要價(jià)值。

5 免疫學(xué)診斷方法

免疫學(xué)診斷是建立在抗原與相應(yīng)抗體發(fā)生可見反應(yīng)這一原理的基礎(chǔ)上，基于病毒中的蛋白設(shè)計(jì)表位疫苗、制備相應(yīng)抗體或是研制血清試劑盒而研發(fā)出免疫診斷方案[40]。免疫學(xué)方法具有較高的敏感性和特異性，在傳染病診斷、病原微生物鑒定以及抗原分析等方面，均有較廣泛的應(yīng)用。目前用于蜜蜂傳染病診斷的主要有瓊脂免疫擴(kuò)散法、膠體金免疫快速診斷技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[41]。張鶴[42]利用抗CSBV單克隆抗體建立了瓊脂擴(kuò)散的檢測(cè)方法。夏曉翠等[43]通過原核表達(dá)CSBV-RDRP蛋白，并免疫新西蘭兔制備其多克隆抗血清，該抗血清能特異結(jié)合感染CSBV的A.cerana cerana血淋巴細(xì)胞，為進(jìn)一步研究CSBV在A.cerana cerana其他組織中的分布和定位提供依據(jù)。李游等[44]以CSBV江西株為研究對(duì)象，制備了針對(duì)CSBV的單克隆抗體與多克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合膠體金免疫層析技術(shù)，采用單抗與多抗的雙抗體夾心法初步研制了針對(duì)CSBV的膠體金快速檢測(cè)試紙，表明所制試紙能檢測(cè)出幼蟲體內(nèi)的SBV病毒。李芳兵[45]等建立了用CSBV的結(jié)構(gòu)蛋白VP2作為包被抗原替代CSBV病毒對(duì)抗CSBV的VP2卵黃抗體進(jìn)行檢測(cè)的間接ELISA方法，該方法的建立為CSBV生物制劑的進(jìn)一步研發(fā)以及檢測(cè)提供了新的思路。李明等[46]以分離到的CSBV基因?yàn)榛A(chǔ)，篩選出抗原性較好的融合蛋白代替CSBV作為免疫原，制備單克隆抗體，成功研制了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，最小檢出量為3.675×10t copies/ul，變異系數(shù)均小于5%，雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法與RT-PCR方法的陽性符合率為88.9%，說明建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法具有很好的檢測(cè)效果。通過免疫注射蛋雞生產(chǎn)卵黃抗體及從卵黃中提取高純度的卵黃抗體（IgY），可用于相應(yīng)疾病的預(yù)防和治療。馬鳴瀟等[47]則以中蜂囊狀幼蟲病毒為增殖模型制備了IgY，應(yīng)用IgY對(duì)感染CSBV的蜂群進(jìn)行治療，治愈率高達(dá)96.25%以上，并且使用方便、特異性強(qiáng)、起效快、不復(fù)發(fā)、無藥物殘留。

6 展望

蜜蜂疾病是影響?zhàn)B蜂生產(chǎn)發(fā)展的障礙，也是影響蜂產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素。而在蜜蜂的飼養(yǎng)管理工作中，對(duì)病原體的鑒定工作是各項(xiàng)防治工作的基礎(chǔ)和依據(jù)。蜜蜂病毒病是所有攻擊蜜蜂的病原菌病中的一種，中蜂囊狀幼蟲病是由囊狀幼蟲病毒引起的一種對(duì)中華蜜蜂毀滅性危害的病害。該病傳播速度極快，危害極大，可造成30%～90%的蜂群損失，是中蜂養(yǎng)殖過程中的主要病害。目前對(duì)蜜蜂病害的防治相關(guān)研究還停留在臨床診斷階段，隨著近幾年該病害發(fā)病率有回升趨勢(shì)，由于臨床癥狀在初期不典型或者呈隱性感染，容易誤診，當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，已經(jīng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，及時(shí)了解該病檢測(cè)的最新方法，有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)病害減少損失。

針對(duì)蜜蜂囊狀幼蟲病毒的檢測(cè)方法包括宏觀水平的臨床診斷技術(shù)與電鏡檢測(cè)方法，微觀水平的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)與免疫學(xué)檢測(cè)方法。在宏觀水平方面，臨床診斷技術(shù)可以較為快速、簡(jiǎn)便、直觀觀察到感染SBV的幼蟲，但該技術(shù)一般用于蜜蜂感染晚期的檢測(cè)，對(duì)防治起不了太大作用；電鏡檢測(cè)方法則具有價(jià)格昂貴，對(duì)設(shè)備和操作人員的技術(shù)要求較高等缺點(diǎn)，目前主要用于科研方向。在微觀水平方面，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)如RT-PCR、LAMP和實(shí)時(shí)定量RT-PCR等憑借其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，成為目前進(jìn)行蜜蜂病毒學(xué)研究的主要工具，但蜜蜂的囊狀幼蟲病毒屬于小RNA樣正鏈病毒，這類病毒易變性強(qiáng)，穩(wěn)定性差，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)在該類病毒檢測(cè)方面也僅局限于定量分析。免疫學(xué)檢測(cè)方法多數(shù)是用蜜蜂囊狀幼蟲病毒蛋白進(jìn)行免疫獲取相應(yīng)的多克隆抗體或單克隆抗體，其具有可行性強(qiáng)、靈敏度高、高效快速等特點(diǎn)，如瓊脂免疫擴(kuò)散法、膠體金免疫快速診斷技術(shù)、CSBV雙抗夾心ELISA方法建立等，但SBV/CSBV無法在體外大規(guī)模化培養(yǎng)，陽性血清比較難獲得，使得免疫學(xué)檢測(cè)方法難于被大范圍推廣。總之，上述方法雖各具優(yōu)缺點(diǎn)，很難在基層生產(chǎn)上推廣。但值得關(guān)注的是，在最新的研究中，研究人員已經(jīng)研制出如膠體金試劑條、雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒等，既快速、簡(jiǎn)便、高效又能夠在基層廣泛使用的檢測(cè)方法，同時(shí)，未來的發(fā)展趨勢(shì)可能集中于LAMPPCR技術(shù)，因?yàn)镺mniAmp DNA聚合酶不但比LAMP中的Bst更穩(wěn)定，更靈敏，不會(huì)被粗樣品中的成分所抑制，而且價(jià)格比Bst更低，大大降低了檢測(cè)成本。

因此，在蜂業(yè)生產(chǎn)過程中及時(shí)檢測(cè)并正確區(qū)分疾病病原，對(duì)于有效阻斷病原傳播、保障蜂產(chǎn)品質(zhì)量具有十分重要的意義。隨著囊狀幼蟲病毒檢測(cè)技術(shù)在診斷蜜蜂疾病上的發(fā)展，尤其是對(duì)蜜蜂病原核酸序列的破譯，將會(huì)使病原的快速檢測(cè)與診斷成為可能。