李文謙，楊江權(quán)，鄒佳益，吳德靜，徐 林，范 芳，葛正龍

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

衰老，為多種因素造成的機(jī)體退行性過程。隨著全球性人口老齡化問題的日益突出，預(yù)計(jì)到2025年，中國60歲以上人口將達(dá)到3億，成為老齡化大國，給現(xiàn)代的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、衛(wèi)生醫(yī)療保障體系帶來一定的沖擊[1]。同時(shí)，衰老也是許多疾病的危險(xiǎn)因素，如阿爾茨海默癥、帕金森病、糖尿病、癌癥等[2-3]。阿爾茨海默癥是一種慢性神經(jīng)退行性病變，也是老年癡呆癥中較常見的類型，發(fā)病率在老年癡呆中占50%～60%。隨著人口老齡化，預(yù)計(jì)到2050年，全球患者將達(dá)到1.5億人[4]。帕金森病是第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，在我國65歲以上人群的患病率為1 700/10萬，患病總?cè)藬?shù)已達(dá)260萬例，約占世界PD患者一半，隨著人口老齡化，預(yù)計(jì)每年新增PD患者20萬例，至2030年將有500萬例[5]，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，揭示衰老本質(zhì)和尋求抗衰老方法、藥物的研究已成為當(dāng)今的世界性重大醫(yī)學(xué)課題。

在抗衰老藥物研究中，中藥及其有效成分對表觀遺傳的作用正日益受到重視，中藥可以作用于表觀遺傳的多個環(huán)節(jié)，參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄及其表達(dá)，包括當(dāng)歸、人參、靈芝、何首烏、三七等，其中以何首烏和靈芝研究最為廣泛[6]。何首烏，是貴州重要的地道藥材之一，為蓼科植物。全株皆可用藥，尤以根部為佳[7]，其干燥塊根味苦、甘、澀,性溫,歸肝、心、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、抗衰老的作用[8-9]，已有研究證實(shí)何首烏在阿爾茨海默病、高脂血癥等疾病中有強(qiáng)大的藥用價(jià)值[10]，可消除衰老動物體內(nèi)自由基[11-12]，達(dá)到抗衰老、延年、保護(hù)心臟的作用[13]，還可通過降低活性氧的產(chǎn)生來達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用[14]。

為了探索何首烏對延緩腦衰老的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)將對何首烏提取液治療D-半乳糖導(dǎo)致的衰老小鼠腦組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)基因(DEG)，為探索何首烏提取液對延緩腦組織衰老的作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級6～8周齡雄性C 57 BL/6小鼠30只，購于陸軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK(遼)015-0001。

1.2 試劑和儀器 D-半乳糖：美國Sigma藥品公司；何首烏粉末：遵義醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，中國；Trizol、氯仿、75%乙醇、異丙醇等試劑自備；冷凍離心機(jī)(MICRO173，美國)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(EFX96，美國)；微量核酸蛋白分析儀(Eppendorf，德國)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(Takara，日本)；TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(Takara，日本)。

1.3 藥物制備 將何首烏粉末與75%乙醇按1∶6進(jìn)行回流煎煮1 h，共進(jìn)行2次，將2次得到的提取液4 000 r/min進(jìn)行離心，取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮回收乙醇至無醇味，使何首烏提取液濃度以生藥計(jì)為1 g/mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 動物分組及建模 將30只6～8周齡雄性C 57 BL/6小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，燈光12 h交替照明，自由飲食。而后隨機(jī)分為空白組(CC)，模型組(MC)，何首烏提取液治療組(MM)，MC組和MM組每天腹腔注射D-半乳糖，連續(xù)60 d，構(gòu)建亞急性衰老動物模型，CC組腹腔注射等量生理鹽水。MM組灌胃何首烏提取液，CC組和MC組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)60 d，然后斷頭處死小鼠，取腦組織于-80 ℃保存?zhèn)溆肹15]。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq) 用mRNA富集法或rRNA去除法對totalRNA進(jìn)行處理，用打斷buffer把獲得的RNA片段化，而后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再合成cDNA二鏈形成雙鏈DNA，把合成的雙鏈DNA末端補(bǔ)平并5′端磷酸化，3′端形成突出一個“A”的粘末端，再連接一個3'端有凸出“T”的鼓泡狀的接頭，而后把連接產(chǎn)物通過特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物熱變性成單鏈后，再用一段橋式引物將單鏈DNA環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA文庫，最后上機(jī)測序。mRNA文庫構(gòu)建由華大基因完成。

2.3 差異表達(dá)基因的GO和KEGG通路分析 Gene Ontology 為功能富集研究的常用分析方法，分為分子功能(Molecular function，MF)、細(xì)胞組分(Cellular component,CC)和生物過程(Biological process,BP)三大功能類。而KEGG是了解高級功能和生物系統(tǒng)的實(shí)用程序數(shù)據(jù)庫。本研究使用DAVID:Functional Annotation Result Summary進(jìn)行基因注釋分析及KEGG通路分析。MC/CC組和MM/MC組選取P<0.05且Count≥10的GO類別被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05且Count≥5的KEGG 通路被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在兩組均有變化的差異基因選取P<0.05且Count≥3的GO類別被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05且Count≥3的KEGG 通路被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成與Hub基因的確定 將測序得到的數(shù)據(jù)庫中差異倍數(shù)為1倍以上并且Q-value≤0.001的基因篩選為差異表達(dá)基因，通過STRING:functional protein association networks進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)數(shù)據(jù)分析，用最低要求的互動分?jǐn)?shù)Inimum required interaction score(medium confidence=0.400)提取PPI對，而后用Cytoscape軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，用Cytoscape中的插件CytoHubba來計(jì)算蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，我們認(rèn)為連接度較高的節(jié)點(diǎn)在維持整個網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性方面更為重要，而前10個基因被認(rèn)為是Hub基因。

2.5 腦組織RNA提取 每個組別取適量腦組織，加入1 mL Trizol后在玻璃勻漿器內(nèi)勻漿，室溫靜置5 min后12 000 g離心5 min，取上清液加入200 μL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5 min后12 000 g 4℃離心15 min，取上清液加入1 mL異丙醇，上下顛倒離心管使其充分混勻，室溫靜置10 min后12 000 g 4℃離心10 min，去掉上清液，向沉淀中加入1 mL 75%乙醇，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，7 500 g 4℃離心5 min，洗2次后棄去上清液，保留沉淀，打開離心管蓋，置室溫干燥幾分鐘，加適量DEPC水溶解，而后用微量核酸蛋白分析儀測定OD260/OD280。結(jié)果在1.8～2.0說明RNA的純度和完整性較好，將完整性較好的RNA取1 μg用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 結(jié)合RNA-Seq數(shù)據(jù)和Hub基因選取表達(dá)量較高的基因用TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，以β-Actin為內(nèi)參，10 μL體系進(jìn)行基因擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?5℃，30 s；GOTO(95℃，5 s；60℃，30 s)；95℃，10 s；60℃，5 s；95℃，50 s；共進(jìn)行40個循環(huán)，而后通過 2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對表達(dá)水平?；蛞镆姳?。

表1 差異表達(dá)基因的Q-PCR引物序列

3 結(jié)果

3.1 差異表達(dá)基因分析 采用DEGseq法對CC組和MC組，MC組和MM組的基因表達(dá)量的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，選取Q-value≤0.001的基因，其基因分布如圖1。MC組和CC組相較，有5 571個基因產(chǎn)生差異表達(dá)，其中331個基因的表達(dá)有明顯差異[|Log2(Fold change)|≥1]，在這些明顯差異基因中，有110個基因上調(diào)，221個基因下調(diào)。而MM組和MC組相較，有4 375個基因產(chǎn)生差異性表達(dá)，其中225個基因的表達(dá)有明顯差異[|Log2(Fold change)|≥1]，在這些明顯差異基因中，有122個基因上調(diào)，103個基因下調(diào)。各組均有變化的基因有103個，其中41個明顯差異基因在MC/CC組上調(diào)，在MM/MC組下調(diào)，62個明顯差異基因在MC/CC組下調(diào)，在MM/MC組上調(diào)。各組差異基因的整體分布情況見火山圖(Volcano-plot)見圖2、圖3。其中上調(diào)的差異基因用紅色表示，下調(diào)的差異基因用藍(lán)色表示，差異不明顯基因用灰色表示。提示何首烏提取液對腦組織的轉(zhuǎn)錄水平有較大影響，可能通過影響腦的轉(zhuǎn)錄組來達(dá)到其抗衰老作用。

圖1 3組樣本共有的差異表達(dá)基因的分布

none：|Log2(Fold change)|<1 ,P>0.05；up：Log2(Fold change)≥1，P≤0.05；down：Log2(Fold change)≤-1，P≤0.05；橫坐標(biāo)代表基因在不同樣本中表達(dá)倍數(shù)變化；縱坐標(biāo)代表基因表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

none：|Log2(Fold change)|<1 ,P>0.05；up：Log2(Fold change)≥1，P≤0.05；down：Log2(Fold change)≤-1，P≤0.05；橫坐標(biāo)代表基因在不同樣本中表達(dá)倍數(shù)變化；縱坐標(biāo)代表基因表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

3.2 差異表達(dá)基因的功能富集分析 使用DAVID進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO功能和KEGG途徑富集分析(見表2～3)。MC組和CC組的GO分析結(jié)果表明差異表達(dá)基因主要富含CCs，包括細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外空間、質(zhì)膜的組成部分，中間絲和編碼角質(zhì)化包膜。BP分析顯示差異表達(dá)基因顯著富集離子轉(zhuǎn)運(yùn)，炎癥應(yīng)答，角化和角化細(xì)胞分化。MF分析顯示差異表達(dá)基因顯著富集結(jié)構(gòu)分子活性，金屬離子結(jié)合和肌動蛋白結(jié)合。而KEGG通路分析的結(jié)果顯示差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路，擴(kuò)張型心肌病通路，心律失常性右心室心肌病(ARVC)通路，肥厚型心肌病(HCM)通路，ECM-受體相互作用通路，蛋白質(zhì)消化吸收通路和雌激素信號通路中。MM組和MC組的GO分析結(jié)果表明差異表達(dá)基因主要富含CCs，包括膜、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外空間、質(zhì)膜的組成部分，中間絲和編碼角質(zhì)化包膜。BP分析顯示差異表達(dá)基因顯著富集離子轉(zhuǎn)運(yùn)，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和炎癥應(yīng)答。MF分析顯示差異表達(dá)基因顯著富集腫瘤壞死因子激活受體活性和離子通道活性。而KEGG通路分析的結(jié)果顯示差異表達(dá)基因顯著富集神經(jīng)活性配體-受體相互作用和ECM-受體相互作用通路中。

表2 CC/MC組差異表達(dá)基因的GO分析及KEGG分析

在MC/CC組和MM/MC組表達(dá)均有明顯差異的103個基因的GO分析和KEGG分析結(jié)果(見表4)顯示，明顯差異基因主要富含CCs，包括膜和質(zhì)膜的組成。BP結(jié)果表示明顯差異基因主要富集在離子遷移和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中。MF結(jié)果表明差異基因主要富集在離子通道活性和鈣調(diào)蛋白結(jié)合中。而KEGG通路分析結(jié)果顯示，明顯差異基因顯著富集在心律失常性右室心肌病通路和細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用通路中。

表4 MC/CC和MM/MC組表達(dá)均有明顯差異的基因的GO分析和KEGG分析

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成與Hub基因的確定 用STRING工具預(yù)測篩選出的103個具有明顯差異表達(dá)基因之間的蛋白質(zhì)的相互作用(見圖4)。PPI網(wǎng)絡(luò)共涉及97個節(jié)點(diǎn)和23個邊緣。通過PPI網(wǎng)絡(luò)中的聚類系數(shù)評估了前10個基因(見表5)。結(jié)果顯示，ATPase肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)1(Atp2a1；degree=2)為最優(yōu)基因，其次為ⅩⅩⅣ型膠原蛋白alpha 1鏈(Col24a1；degree=2)，Kelch-like 41(Klhl41；degree=2)，肌鈣蛋白T1，慢骨骼型(Tnnt1；degree=2)，鉀電壓門控通道亞家族H成員5(Kcnh5；degree=2)，腫瘤壞死因子受體超家族成員4(Tnfrsf4；degree=2)，X連鎖Kx血型相關(guān)4(Xkr4；degree=2)，磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(Plcxd3；degree=2)，GPRIN家庭成員3(Gprin3；degree=2)，二?；视图っ?Dgkh；degree=1)。結(jié)合RNA-Seq結(jié)果,選取表達(dá)量較高的Tnfrsf4、Xkr4、Gprin3、Plcxd34個基因進(jìn)行驗(yàn)證。其中Tnfrsf4在MC組下調(diào)，MM組上調(diào)；Xkr4、Gprin3、Plcxd33個基因在MC組上調(diào)，MM組下調(diào)。

表3 MC/MM組差異表達(dá)基因的GO分析及KEGG分析

圖4 差異表達(dá)基因構(gòu)建的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

表5 前10個中心基因

3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 RT-qPCR結(jié)果顯示，與空白對照組(CC)比較，衰老細(xì)胞組(MC)中的Tnfrsf4表達(dá)水平下調(diào)，Xkr4、Gprin3、Plcxd3表達(dá)水平上調(diào)。與MC組比較，何首烏提取液治療組(MM)中的Tnfrsf4表達(dá)水平上調(diào)，Xkr4、Gprin3、Plcxd3表達(dá)水平下調(diào)(見圖5)，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與RNA-seq測序結(jié)果一致(見表6)。

A：Tnfrsf4RT-qPCR結(jié)果；B：Xkr4RT-qPCR結(jié)果；C：Gprin3RT-qPCR；D：Plcxd3RT-qPCR結(jié)果衰老組與空白對照組比較，#：P<0.05，##：P<0.01，何首烏提取液治療組與D-Gal衰老組比較。

表6 Tnfrsf4、Xkr4、Gprin3、Plcxd3在轉(zhuǎn)錄組測序中的表達(dá)

4 討論

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從整體轉(zhuǎn)錄水平系統(tǒng)研究基因轉(zhuǎn)錄圖譜并揭示復(fù)雜生物學(xué)通路和性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)制的學(xué)科[16]。通過轉(zhuǎn)錄組測序可以對全部轉(zhuǎn)錄組或基因組的基因進(jìn)行差異性篩選[17]，本實(shí)驗(yàn)通過對篩選出的差異表達(dá)基因的分析，找出各組間的表達(dá)差異，初步確定何首烏延緩腦衰老的潛在作用靶點(diǎn)。

生物的衰老是一個極其復(fù)雜的生物化學(xué)過程，它涉及蛋白質(zhì)、脂類和核酸等顯著性的改變，體現(xiàn)在生理完整性的逐步丟失，從而導(dǎo)致功能衰退，引發(fā)與年齡有關(guān)的疾病，包括神經(jīng)退行性疾病、動脈粥樣硬化、癌癥等，提高死亡的風(fēng)險(xiǎn)性[18-19]。而腦衰老是其中一個重要的表現(xiàn)。衰老時(shí)，病變最先發(fā)生于海馬區(qū)域，而后增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞敏感性，使凋亡幾率增加，進(jìn)而引起神經(jīng)退行性疾病[20]，如阿爾茨海默病、帕金森病等。若凋亡機(jī)制發(fā)生過多，則會造成不可逆的細(xì)胞丟失，嚴(yán)重的可引起缺血性損傷和自身免疫病等[21-22]。

Tnfrsf4是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的成員，通常被認(rèn)為是一種共刺激分子[23-24]。研究表明，敲除Tnfrsf4后，抗凋亡分子、凋亡抑制劑Bcl-2、Bcl-xL和Survivin的表達(dá)顯著減少，而促凋亡蛋白BCL2L11的表達(dá)顯著增加[25]。在本研究中，GO及KEGG結(jié)果亦表明，Tnfrsf4主要參與炎癥反應(yīng)過程、免疫反應(yīng)過程并調(diào)控凋亡；轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常組比較，衰老模型組中Tnfrsf4呈現(xiàn)低表達(dá)，而在經(jīng)何首烏灌胃后的小鼠腦組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，因此，何首烏可能通過上調(diào)Tnfrsf4，使促凋亡蛋白減少而抗凋亡蛋白增加來達(dá)到延緩衰老的作用。Xkr4(XK-Kell血型復(fù)合亞單位相關(guān)家族，成員4)在小腦中廣泛表達(dá)[26-27]，并且與McLeod綜合征有關(guān)，包括運(yùn)動、認(rèn)知和精神障礙[28]。Suzuki J等人研究發(fā)現(xiàn)，凋亡細(xì)胞將磷脂酰絲氨酸(PtdSer)暴露在其表面，作為“吞噬我”的信號。而Xkr4可以組織特異性地支持凋亡的PtdSer暴露[29]，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在本研究中，GO及KEGG結(jié)果亦表明，Xkr4主要為膜的組成部分，同時(shí)參與細(xì)胞凋亡過程；而轉(zhuǎn)錄組測序和RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常組比較，衰老模型組中的Xkr4表達(dá)增加，而經(jīng)何首烏灌胃后的小鼠腦組織中的表達(dá)量降低，因此，何首烏可能通過下調(diào)Xkr4來抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而達(dá)到延緩衰老的作用。Gprin3為GPRIN家族成員3，是紋狀體中D2R功能的假定選擇性控制器，在紋狀體相關(guān)行為和細(xì)胞功能中起關(guān)鍵作用，用以解決與D2R相關(guān)的紋狀體功能障礙，例如精神分裂癥，帕金森病等[30]。楊嬋的研究表明參芪復(fù)方可通過靶向調(diào)節(jié)Gprin3來調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，抑制炎癥反應(yīng)[31]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，衰老模型組的Gprin3表達(dá)增高，經(jīng)何首烏灌胃治療后的小鼠腦組織中的Gprin3表達(dá)降低，與楊嬋的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；而GO和KEGG的結(jié)果表明Gprin3參與調(diào)控凋亡過程。因此，何首烏通過下調(diào)Gprin3達(dá)到延緩衰老的作用機(jī)制可能與參芪復(fù)方控制細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制相似。Plcxd3是磷酸肌醇特異性磷脂酶(PI-PLC)家族成員，是Gellatly等于2012年鑒定出的一類新的PI-PLC，因其結(jié)構(gòu)中僅包含一個催化X結(jié)構(gòu)域，稱為含磷脂酶C X結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(PLCXD3)，在信使RNA(mRNA)水平上，Plcxd3表達(dá)在大腦中占主導(dǎo)地位[32]，當(dāng)表達(dá)量降低時(shí)，機(jī)體胰島素分泌受損[33-34]。Plcxd3編碼的蛋白質(zhì)參與磷酸肌醇信號通路，該通路與雙相情感障礙有關(guān)[35]。雙相情感障礙是一種嚴(yán)重的神經(jīng)精神疾病，其特征是躁狂和抑郁癥反復(fù)發(fā)作，影響思想、知覺、情感和社交行為[36]。有研究表明，雙向情感障礙與衰老加速相關(guān)，但這種關(guān)聯(lián)的基礎(chǔ)機(jī)制尚不清楚[37]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，衰老模型組中的Plcxd3表達(dá)增高，經(jīng)何首烏灌胃治療后的小鼠腦組織中表達(dá)量降低；而GO和KEGG的結(jié)果表明Plcxd3主要參與脂質(zhì)分解代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并具有水解酶活性和磷酸二酯水解酶活性。因此，何首烏可能通過下調(diào)Plcxd3來影響脂質(zhì)的分解代謝，進(jìn)而達(dá)到延緩衰老的作用，同時(shí)緩解雙向情感障礙癥狀。

綜上所述，何首烏可能通過上調(diào)Tnfrsf4的表達(dá)，下調(diào)Xkr4、Gprin3、Plcxd3的表達(dá)水平來調(diào)控凋亡過程，達(dá)到抗衰老的作用。