王小妹，畢曉英，馬 銳，賀曉燕，馬 龍，姚新生

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室，貴州 遵義 563099; 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗與病理中心，湖南 長沙 410000)

乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的以肝臟炎性病變?yōu)橹鞑⒖梢鸲嗥鞴贀p害的一種傳染病，是一種全球性的傳染性疾病。據(jù)報道[1],全球HBsAg陽性人群占到了全球總?cè)藬?shù)的4%～9%,近3.64億人。每年約有100萬人死于因HBV感染而導(dǎo)致的肝衰竭、肝硬化和肝癌等疾病。我國屬于HBV高地方性流行地區(qū)。目前我國乙肝病毒攜帶者人數(shù)有近1.2億,約占全球的45%,乙肝表面抗原攜帶者人數(shù)為全球最多,發(fā)病率一直處于法定傳染病的前列；尤其高等院校的在校大學(xué)生感染人數(shù)居高不下，高校大學(xué)生乙肝感染率高達(dá)6%～8%[2]。但僅人類等少數(shù)靈長類的動物能被HBV感染，理想的HBV感染體外細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型比較難以建立，故而很大程度地限制了對HBV的生物學(xué)特征及其詳細(xì)致病機制的深層次研究。有研究者通過建立HBV 轉(zhuǎn)基因模型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示HBV引起的肝臟炎癥過程中，由HBV抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答起到了重要作用[3]。HBV抗原介導(dǎo)的活化T細(xì)胞免疫應(yīng)答紊亂是HBV持續(xù)存在和造成炎癥反復(fù)活動的重要原因。但是，HBV感染機體后，T細(xì)胞參與機體免疫應(yīng)答和耐受的詳細(xì)機制仍沒有具體闡明[4-6]。Yang等[7-8]利用GMSP(Gene melting spectral pattern)方法檢測到了急性乙肝病毒感染痊愈患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞家族取用的偏向，可能是針對乙肝病毒應(yīng)答導(dǎo)致了T細(xì)胞偏向取用了部分家族及恒定表達(dá)CDR3譜系，并輔助其特異的B 細(xì)胞應(yīng)答。

國內(nèi)外大量研究成果提示基因重組HBV疫苗的接種能很好的預(yù)防HBV的感染和乙肝的發(fā)病[9-12]。通過接種HBV疫苗，HBV能誘發(fā)機體發(fā)生細(xì)胞免疫應(yīng)答及體液免疫應(yīng)答。CD8+毒性T 細(xì)胞(CTL)、特異的CD4+輔助性T 細(xì)胞(Th 細(xì)胞)、非特異的單核巨噬細(xì)胞(MΦ)、自然殺傷細(xì)胞(NK 細(xì)胞)及部分細(xì)胞因子等免疫分子會參與到其免疫應(yīng)答與病毒清除的過程中。而只有90%左右個體在乙肝疫苗接種后會產(chǎn)生HBsAb，部分接種HBV疫苗個體基本不產(chǎn)生HBsAb，即不應(yīng)答現(xiàn)象，而相關(guān)機制仍未完全闡明[13]。另外，不同人群對HBV的應(yīng)答反應(yīng)強弱、藥物對不同乙型肝炎人群的治療效果及乙型肝炎患者發(fā)展為肝硬化和肝癌的概率等，均與個體對HBV應(yīng)答的不同優(yōu)勢T細(xì)胞表位、不同個體的HLA型別(特異的不同民族HLA背景)、T細(xì)胞在炎癥過程中應(yīng)答、耐受消長情況等密切相關(guān)[14-15]。

近年來，研究者將T/BCR CDR3免疫譜型分析研究應(yīng)用到感染(如HBV攜帶者、CHB患者、CHB治療前后)、自身免疫相關(guān)疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病)、腫瘤(如T淋巴細(xì)胞白血病)及其他特異B/T細(xì)胞B/TCR分子機制及相關(guān)特征的研究[7-8]。Ma等[16]通過BCR CDR3譜系分析發(fā)現(xiàn)個體間未找到完全相同的IgG或IgM H 鏈 CDR3氨基酸序列，考慮為個體間不同的HLA-DR位點、抗原提呈和T細(xì)胞輔助激活B 細(xì)胞的差異造成。群體間VDJ基因重組表現(xiàn)出差異很大，但在IgAN病人中，發(fā)現(xiàn)了4個高頻取用的VDJ 基因重組序列[17]。Shi等[18]通過對正常人外周血TCR CDR3譜系分析發(fā)現(xiàn)了假基因的V區(qū)取用缺失分布特征及功能基因在J和D基因取用上的特征。

核酸分子檢測方法中，實時熒光定量PCR技術(shù)的準(zhǔn)確性、敏感性及重復(fù)性均處于領(lǐng)先水平；可通過該方法得到相應(yīng)的產(chǎn)物的熔解曲線走向圖，進(jìn)而分析個體整體TRBV家族CDR3 基因克隆性增生情況。本實驗采用熒光定量PCR熔解曲線法分析HBV疫苗志愿者外周血中CD4+TCRβ鏈CDR3區(qū)表達(dá)特征，從分子免疫的角度來觀察不同民族志愿接種者的T細(xì)胞對HBV疫苗的應(yīng)答狀況，觀察T細(xì)胞應(yīng)答在機體對HBV疫苗應(yīng)答中的作用；并通過對同一HLA型別志愿者PBL CD4+T細(xì)胞TCRβCDR3譜系分析，找到機體T細(xì)胞對HBV應(yīng)答的可能特異性TCR CDR3序列，分析其共性及可能產(chǎn)生的機制，為研發(fā)新的HBV表位疫苗及對相同HLA型別HBV患者進(jìn)行個體化診治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 20例HBV疫苗接種志愿者(漢族、布依族、苗族、侗族)均為遵義醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)本科學(xué)生。在獲得遵義醫(yī)科大學(xué)倫理委員會認(rèn)可和志愿者知情同意后，排除自身免疫性疾病及惡性腫瘤，用電化學(xué)發(fā)光法檢測所有志愿者乙肝全套(乙肝表面抗原、抗體，乙肝e抗原、抗體，乙肝核心抗體)，乙肝五項全部陰性的志愿者則符合本次研究要求；每位志愿者注射3次HBV疫苗，并采血3次。采血時間分別為第1次HBV疫苗接種前1 d、第2次HBV疫苗接種14 d后、第3次HBV疫苗接種14 d后，每次采15 mL靜脈血。

1.1.2 主要實驗試劑 HBV疫苗(深圳康泰生物制品有限公司)；MACSRCD8MicroBeads磁珠(Miltenyi Biotec)；MACS柱子(Miltenyi Biotec)；熒光定量PCRKit(東洋坊，日本)；cDNA合成試劑盒(MBI Fermentas)；總RNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek，美國)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司)；淋巴細(xì)胞分離液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；TRBV24個家族、TRBC、GAPDH等引物(上海Invitrogene公司合成)；Goldview TM 核酸染料(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)；Percp Anti-human(BD公司，美國)；FITC Anti-human CD4(BD公司，美國)；Percp/FITC/PE Mouse IgG1(BD公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 每例健康志愿者均采用0、1、6月HBV疫苗接種的原則(0.5 mL/次)。

1.2.2 采集外周血時間 第1次接種的前1天、第2次接種后第14天和第3次接種后的第14天(15 mL/次)。

1.2.3 采用密度梯度離心法分離PBL中的單個核細(xì)胞。

1.2.4 志愿者PBL中CD4+T細(xì)胞采用磁珠法進(jìn)行分選。

1.2.5 采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞的純度。

1.2.6 HLA基因組分型 取志愿者5 mL外周血(EDTAk2抗凝)，采用PCR-SBT法分型，即采用群特異性引物(5'端加尾修飾)對靶DNA進(jìn)行擴增，然后通過特異性引物對獲取的擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序，再與HLA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后對待測標(biāo)本進(jìn)行HLA分型(由深圳華大基因研究院完成)。

1.2.7 提取淋巴細(xì)胞CD4+T細(xì)胞總RNA并合成cDNA。

1.2.8 采用FQ-PCR 對CD4+T細(xì)胞的TRBV家族CDR3區(qū)段cDNA進(jìn)行擴增 T細(xì)胞TRBV 26個家族上游引物根據(jù)文獻(xiàn)[19-20]而設(shè)計并合成，并在β鏈恒定區(qū)選取、設(shè)計下游引物和對照引物(引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)。體系的反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min，1個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，運行45個循環(huán)；72 ℃ 10 min運行1個循環(huán); 75～95 ℃按0.2 ℃/s對熒光值進(jìn)行監(jiān)測，運行100個循環(huán)，熔解曲線分析后的PCR產(chǎn)物再按照上述相同反應(yīng)條件及步驟，將45個循環(huán)改成5個循環(huán)后進(jìn)行PCR擴增，并用8微升產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠(1.5%)上進(jìn)行電泳,剩余產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.9 對克隆性增殖的CD4+T細(xì)胞TRBV家族CDR3區(qū)進(jìn)行PCR擴增 反應(yīng)條件：(1)94 ℃ 3 min運行1個循環(huán)；(2)94 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，運行35個循環(huán)；(3)72 ℃ 10 min運行1個循環(huán)。將產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.10 對普通瓊脂糖凝膠中的CD4+T細(xì)胞26個TRBV家族的PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行回收并純化。

1.2.11 對克隆性增殖的CD4+T細(xì)胞TRBV家族CDR3區(qū)段進(jìn)行測序,應(yīng)用IMGT databas分析CDR3區(qū)的基因并對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 20例HBV疫苗志愿接種者不同時間段乙肝表面抗體(HBsAb)檢測值 20例疫苗志愿接種者HBV疫苗接種前乙肝五項檢測陰性；接種重組乙肝疫苗后，篩選的HBV疫苗接種志愿者均產(chǎn)生了保護(hù)性反應(yīng)(完成全程接種后產(chǎn)生的HbsAb的滴度：<2.1 IU/L為無反應(yīng)；2.1～10 IU/L為弱反應(yīng)；>10 IU/L為有保護(hù)反應(yīng))，見表1。

表1 20例HBV疫苗志愿接種者不同時間段乙肝表面抗體(HBsAb)檢測值

2.2 20例HBV疫苗志愿接種者的基本資料及HLA-DR檢測分型(見表2)

表2 20例HBV疫苗志愿接種者的基本資料及HLA-DR分型結(jié)果

2.3 采用MACSRCD8 MicroBeads磁珠對PBL中的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行分選，CD4+T細(xì)胞為去除CD8+T細(xì)胞后的PBL；分選CD8+T細(xì)胞的純度全部>80%(流式細(xì)胞術(shù))。再采用熒光定量PCR(FQ-PCR)溶解曲線法對乙肝疫苗志愿接種者PBL中CD4+細(xì)胞TCR VβCDR3分子特征進(jìn)行分析(見圖1～3)，并對相關(guān)特征進(jìn)行統(tǒng)計(見表3～4)。

圖1 1號HBV疫苗志愿者接種前 CD4+ T細(xì)胞的26個TRBV家族CDR3區(qū)擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 1號HBV疫苗志愿接種者接種前 CD4+T細(xì)胞TRBV家族(26個)的CDR3區(qū)擴增曲線

表3 20例HBV疫苗接種者接種過程中CD4+T細(xì)胞的TRBV家族(26個)出現(xiàn)的優(yōu)勢家族統(tǒng)計

表4 具有共同優(yōu)勢取用CD4+T細(xì)胞 TRBV家族的個體統(tǒng)計

3 討論

在無特異性抗原刺激的情況下，理論上正常人TCRβ鏈基因重排應(yīng)是呈隨機取用狀態(tài)的，故而正常人外周血T細(xì)胞β鏈TCR CDR3家族的取用一般呈現(xiàn)為多克隆性增生狀態(tài)，在熔解曲線上則表現(xiàn)為多峰。如果機體被抗原刺激，TCR CDR3區(qū)會特異性識別相應(yīng)抗原，進(jìn)而體內(nèi)特異性T細(xì)胞會出現(xiàn)優(yōu)勢擴增，所以可以通過分析TCR CDR3優(yōu)勢取用情況，進(jìn)而來分析T細(xì)胞克隆性[21]。

在方法學(xué)上，本研究取用適合于臨床樣本操作、快速又簡便的熒光定量熔解曲線法對乙肝疫苗志愿者接種全程(包括接種前/后)CD4+T細(xì)胞TCRβ鏈各家族CDR3區(qū)基因的取用特征進(jìn)行分析，從整體水平上對特異性T細(xì)胞克隆增生特點進(jìn)行探討，為乙肝發(fā)病機制的研究及進(jìn)一步進(jìn)行乙肝個體化的診療提供新的方向及途徑。本研究采用乙肝五項均為陰性的志愿者(漢族、布依族、苗族、侗族)接種HBV疫苗前及接種后的外周血為實驗標(biāo)本，分析發(fā)現(xiàn)疫苗接種前志愿者PBL的TCRβ鏈各家族CDR3區(qū)基因基本呈多克隆增生(多峰)分布,說明各個TRBV家族均取用了多種CDR3區(qū)基因；另外，本研究分析發(fā)現(xiàn)所有乙肝疫苗接種志愿者在接種了乙肝疫苗后PBL標(biāo)本中均表現(xiàn)出有一個或幾個TRBV家族的單克隆性表達(dá)的現(xiàn)象(優(yōu)勢取用)，這種現(xiàn)象提示乙肝疫苗志愿者接種乙肝疫苗后T細(xì)胞免疫應(yīng)答與未接種前表現(xiàn)出了明顯變化；本分析現(xiàn)象與系統(tǒng)性紅斑狼瘡個體中的TCR CDR3取用分析結(jié)論一致[22]。

第2次疫苗接種后第14天，對20例HBV疫苗志愿者取外周血進(jìn)行HbsAb檢測(電化學(xué)發(fā)光法)，有6例志愿者抗體陰性，即檢測值<10 IU/L,他們分別是1(侗族)、4(侗族)、6(苗族)、7(布依族)、8(布依族)、11(布依族)號志愿者；在第三次疫苗接種后，20例HBV疫苗志愿者HbsAb都為陽性，即檢測值>10 IU/L，其中2(侗族)、9(苗族)、10(布依族)、13(布依族)、14(苗族)號志愿者HBsAb檢測值均>1000 IU/L。提示HBV疫苗接種后，志愿者均對疫苗產(chǎn)生了特異應(yīng)答；而在不同時期，TCR CDR3的優(yōu)勢表達(dá)情況可能不盡相同。

在本實驗中，以疫苗前的TRBV熔解曲線峰圖為判斷基準(zhǔn)(對照)，分別與第二次乙肝疫苗接種后14 d及第3次乙肝疫苗接種后14 d的TRBV譜系熔解曲線峰圖比對，從而觀察TRBV譜系變化特征。在疫苗接種期間表現(xiàn)為某TRBV家族的優(yōu)勢單峰取用，當(dāng)抗原被機體清除后，可能會恢復(fù)為多峰狀態(tài)，對相應(yīng)抗原的應(yīng)答將會以記憶細(xì)胞的形式存在于機體中。對比發(fā)現(xiàn)，接種HBV疫苗后各位志愿者CD4+T細(xì)胞優(yōu)勢取用的TRBV家族表現(xiàn)出不完全一致，但不同志愿者之間存在著共同優(yōu)勢取用的TRBV家族。

20例志愿者HLA-DR位點分型表現(xiàn)出對HLA-DR位點有共同優(yōu)勢取用現(xiàn)象，如13(布依族)和16(漢族)號兩個志愿者具有相同的HLA-DR位點，分別是DRB1*0901和DRB1*1101；DRB1*0901和DRB1*1602位點分別被6例志愿者取用，而部分位點則被單例志愿者所取用，如DRB1*0403僅被3號志愿者取用。通過對比HLA-DR取用表和優(yōu)勢家族取用表，不同個體乙肝疫苗接種后優(yōu)勢TRBV家族的取用和HLA-DR位點未表現(xiàn)出明顯相關(guān)性。此結(jié)果提示我們這些優(yōu)勢利用的T細(xì)胞可能會識別乙肝病毒抗原肽的不同抗原表位，除與HLA型別相關(guān)外，可能還與TCR CDR3區(qū)的空間構(gòu)型及本身的結(jié)構(gòu)具有相關(guān)性。

布依族志愿者10、11、12共同優(yōu)勢取用TRBV9和TRBV14；漢族志愿者16、17、19共同優(yōu)勢取用TRBV9，另漢族志愿者16和19還共同取用TRBV13.1；漢族志愿者16和17共同取用TRBV8，提示TRBV優(yōu)勢家族的利用與民族屬性或具有一定相關(guān)性。

不同個體的優(yōu)勢取用家族不完全相同，此結(jié)果與Tajiri[23]等對HBsAg特異性結(jié)合的單克隆抗體序列分析結(jié)果一致。Tajiri等分析了31條(記憶B細(xì)胞來源序列5條，漿細(xì)胞來源序列26條)HbsAb序列，這些序列與HBsAg呈現(xiàn)高親和力，但家族來源呈現(xiàn)異質(zhì)性?？紤]為目前使用的基因重組HBV疫苗具有能引起機體體液免疫應(yīng)答的多個HBsAg的構(gòu)象表位，激活了個體的多個B 細(xì)胞克隆。

TCR CDR3譜系特征分析技術(shù)已應(yīng)用于多項研究[24-28]，本次在HBV疫苗研究中也顯現(xiàn)了重大的應(yīng)用價值，表現(xiàn)出潛在的臨床應(yīng)用前景。本實驗采用熒光定量PCR熔解曲線法分析HBV疫苗志愿者外周血中CD4+TCRβ鏈CDR3區(qū)表達(dá)特征，從分子免疫的角度來觀察不同民族志愿接種者的T細(xì)胞對HBV疫苗的應(yīng)答狀況，觀察T細(xì)胞應(yīng)答在機體對HBV疫苗應(yīng)答中的作用；并通過對同一HLA型別志愿者PBL CD4+T細(xì)胞TCRβCDR3譜系分析，找到機體T細(xì)胞對HBV應(yīng)答的可能特異性TCR CDR3序列，分析其共性及可能產(chǎn)生的機制，本研究結(jié)果為乙肝患者的T細(xì)胞應(yīng)答機制解析及進(jìn)一步的乙肝患者的個體化治療、開發(fā)新的乙肝表位疫苗、T細(xì)胞在HBV感染后的應(yīng)答與耐受分析及少數(shù)民族乙肝感染后T細(xì)胞TRBV家族取用特征分析等研究提供了實驗基礎(chǔ)。