韓克松，張 帆，李翠玲，張 靜，邸泰霖，肖德亮

結(jié)直腸癌是世界第三大惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增加，發(fā)病年齡逐漸年輕化，臨床上主要采用手術(shù)切除治療，但術(shù)后五年生存率仍然較低[1]。結(jié)直腸癌患者早期臨床癥狀不明顯，早期篩查和診斷率很低，大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于晚期。尋找簡單可靠的結(jié)直腸癌預后指標對早期篩查，治療和預后評估具有重要的意義。與腫瘤相關(guān)的炎性細胞可以直接或間接與腫瘤相互作用，促進腫瘤血管生成，細胞外基質(zhì)重塑和腫瘤轉(zhuǎn)移[2]。中性粒細胞淋巴細胞比值（NLR）可以作為全身炎癥反應的指標，評估人體抗腫瘤和促腫瘤免疫之間的動態(tài)平衡[3]。研究證實NLR與卵巢癌、肺癌、乳腺癌和肝細胞癌等多種惡性腫瘤的預后有關(guān)[4]。T淋巴細胞必須在參與免疫反應前首先被激活，CD69是T淋巴細胞活化的分子標記，可誘導Th1類細胞因子。T淋巴細胞在靜止狀態(tài)下不表達，但是一旦T淋巴細胞被激活，黏附在表面的CD69就會以非?？斓乃俣缺磉_。一般認為，在腫瘤發(fā)生后為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造環(huán)境，并且在患者接受相應治療前，體內(nèi)的免疫功能通常很低，因此可以通過分泌一些免疫因子來抑制免疫功能[5]。本研究通過檢測126例結(jié)直腸癌患者外周血中T淋巴細胞CD69、NLR水平，以期探討結(jié)直腸癌患者術(shù)前外周血中T淋巴細胞CD69、NLR變化的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年5月—2018年12月我院收治的126例結(jié)直腸癌患者（病例組）、120例結(jié)腸息肉患者（對照組）。納入標準：1）結(jié)直腸癌、結(jié)腸息肉的診斷標準參考人民衛(wèi)生出版社《外科學》第七版中的標準[6]；2）術(shù)前經(jīng)結(jié)直腸鏡取活組織病理學檢查證實診斷；3）所有患者均在我院接受腹腔鏡根治手術(shù)治療，術(shù)后取標本接受病理學檢查；4）本研究符合醫(yī)學倫理委員會的相關(guān)要求，獲得研究對象的知情同意。排除標準：1）術(shù)前具有放化療病史；2）術(shù)前接受免疫學治療；3）病理學資料缺失；4）伴有其他部位的惡性腫瘤。

病例組中男68例、女58例，年齡39～75歲，平均（55.2±7.8）歲；體質(zhì)指數(shù)（BMI）（22.8±2.2）kg/m2；其中結(jié)腸癌47例、直腸癌79例；TNM分期：Ⅰ期27例、Ⅱ期45例、Ⅲ期44例、Ⅳ期10例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例。對照組中男61例，女59例；年齡36～75歲，平均（53.8±8.4）歲；BMI（22.6±2.4）kg/m2；兩組年齡、性別、BMI差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 指標檢測方法

1.2.1 NLR 患者禁食12 h，取3 mL外周靜脈血。用貝克曼庫爾特LH750自動血液分析儀測量中性粒細胞計數(shù)，淋巴細胞計數(shù)，計算NLR。

1.2.2 CD69 收集患者100 μL全血，加入20 μL熒光標記的CD69抗體（APC、FITC、PE標記抗人CD69單抗），APC、FITC、PE波長分別不同，分別選擇深紅色、亮綠色和橘紅色3個流式通道，以防止熒光的重疊和相互干擾，影響最后結(jié)果。在室溫下避光孵育20 min；加入1 mL溶血素，室溫避光10 min；加入1 mL PBS緩沖液，混合，以1 000 r/min離心5 min；棄去上清液，再次加入1 mL PBS緩沖液，重復混合并離心；棄去上清液，加入0.5 mL PBS緩沖液進行流式細胞術(shù)，使用Cell Quest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。

1.3 資料收集 收集病例組的年齡、性別、BMI、腫瘤位置、直徑大小、病理學類型、腫瘤分化程度、是否伴有腸梗阻、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤淋巴血管侵犯。

2 結(jié)果

2.1 病例組和對照組的外周血中T淋巴細胞CD69、NLR比較 病例組外周血中T淋巴細胞CD69表達水平低于對照組，NLR值高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 病例組和對照組的外周血中T淋巴細胞CD69、NLR比較

2.2 外周血中T淋巴細胞CD69表達與結(jié)直腸癌患者病理學特征的關(guān)系 不同腫瘤分化程度、不同TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否發(fā)生腫瘤淋巴血管侵犯的結(jié)直腸癌患者T淋巴細胞CD69表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 外周血中T淋巴細胞CD69表達與結(jié)直腸癌患者病理學特征的關(guān)系

2.3 外周血中NLR值與結(jié)直腸癌患者病理學特征的關(guān)系 不同腫瘤分化程度、不同TNM分期、是否發(fā)生腫瘤淋巴血管侵犯的結(jié)直腸癌患者的血NLR值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 外周血中NLR值與結(jié)直腸癌病理學特征的關(guān)系

3 討論

對于結(jié)直腸癌患者的預后評價，主要包括腫瘤分化程度，淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移，臨床分期等[7]。但是除了傳統(tǒng)的臨床病理指標外，影響患者的預后因素較多。相關(guān)研究表明慢性炎癥逐漸發(fā)展惡化會導致許多惡性腫瘤的發(fā)生[8-9]。腫瘤的炎癥反應和宿主的保護性免疫能力是相互關(guān)聯(lián)的動態(tài)過程，當炎癥反應發(fā)生改變打破動態(tài)平衡時引起腫瘤的生長發(fā)育。因此，尋找準確易得的指標反映腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要意義。慢性炎癥反應會產(chǎn)生一些毒素應激，同時炎癥細胞通過增加血管生成和組織浸潤來誘導細胞增殖，促進癌癥的發(fā)展和擴散[10]。研究表明中性粒細胞，淋巴細胞，血小板和單核細胞等炎癥細胞和人體固有的免疫系統(tǒng)信號分子參與了腫瘤的發(fā)展[11-12]。與腫瘤病理分期相比，各種炎癥細胞的數(shù)量變化可能對癌癥患者術(shù)前狀態(tài)有更好的了解[13]。NLR是系統(tǒng)性炎癥反應的代表性指標，可以用于結(jié)直腸癌患者的潛在預后因素研究。

NLR是反映機體免疫狀態(tài)的重要指標，其水平高低與腫瘤特點有關(guān)。腫瘤發(fā)生時，患者機體中性粒細胞的含量增加，活化并從靜脈系統(tǒng)遷移到腫瘤細胞周圍，促進腫瘤發(fā)展[14-15]。另一方面，全身性炎癥反應使宿主的CD4+ T淋巴細胞含量減少，CD8 + T淋巴細胞的增加受抑制，大大降低了人體的細胞免疫力[16]。腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與免疫逃逸有關(guān)，T細胞的活化在免疫監(jiān)視中具有重要作用[17]。CD69是T淋巴細胞活化后表達的膜表面分子，當受到激活后，它可以進一步刺激T細胞的增殖和活化過程，誘導Th1類細胞因子的分泌，并間接殺死腫瘤，我們可以檢測CD69表達的激活情況，以驗證T淋巴細胞的激活情況，并探討切除腫瘤后是否可以逆轉(zhuǎn)腫瘤患者的免疫抑制作用。T淋巴細胞表面上有許多標志性分子，而CD69是最早表達的分子。因此，以前的研究通常在腫瘤患者手術(shù)后的第一天檢測CD69的表達[18]。

本次研究結(jié)果顯示，病例組的外周血中T淋巴細胞CD69表達明顯低于對照組。主要由于結(jié)直腸癌患者體內(nèi)T細胞活化不足，難以進行腫瘤免疫監(jiān)視，導致手術(shù)前腫瘤免疫抑制，更有利于腫瘤的生長，浸潤和轉(zhuǎn)移。病例組 NLR值明顯高于對照組。由癌癥引起的炎癥反應可導致NLR比例增加，NLR升高表示中性粒細胞數(shù)量增加，淋巴細胞數(shù)量減少。淋巴細胞是抗腫瘤免疫力的主要成分，數(shù)量減少表明人體免疫功能異常，淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫力下降，從而促進了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。更重要的是，NLR可能在促進腫瘤炎癥和抗腫瘤炎癥之間起到平衡作用。本研究顯示，NLR值變化與患者不同腫瘤分化程度、不同TNM分期、是否發(fā)生腫瘤淋巴血管侵犯密切相關(guān)。隨著腫瘤的發(fā)展，人體的全身炎癥反應和抗腫瘤免疫抑制不平衡。腫瘤TNM分期增加，腫瘤分化嚴重，發(fā)生腫瘤淋巴血管侵犯，使得中性粒細胞和淋巴細胞比例失調(diào)，NLR不僅反映了腫瘤的進展程度，還表明人體對腫瘤的免疫力降低，這對臨床治療計劃和預測患者預后具有重要意義。

在當前的臨床工作中，炎癥反應指數(shù)NLR的增加已被證明與惡性腫瘤的預后有關(guān)，并且在結(jié)直腸癌，肺癌，肝癌和胃癌的研究中已被廣泛報道[19-20]。但目前較多結(jié)直腸癌研究中僅對NLR單一指標進行檢測，說明性不強。本研究對結(jié)直腸癌患者術(shù)前進行T淋巴細胞CD69和NLR進行檢測，充分說明結(jié)腸癌患者機體免疫炎癥反應變化，探討其與腫瘤的進展關(guān)系。在以后的研究中，是否可以使用抗炎治療來提高結(jié)直腸癌對化療藥物的敏感性并延長患者的生存期，值得進一步探討。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者的外周血中T淋巴細胞CD69表達降低，NLR值增高，并且與腫瘤的進展有一定的關(guān)系。