王 淼，萬銳杰，劉 偉，彭 科

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是老年人群中最常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，據(jù)統(tǒng)計，致使成人殘疾的第四大原因也是骨關(guān)節(jié)炎[1-2]。OA發(fā)病過程涉及關(guān)節(jié)軟骨退化和軟骨下骨的重塑，其潛在病因包括炎癥、機械損傷、氧化應(yīng)激、衰老、肥胖和糖尿病，這些都會導(dǎo)致OA的發(fā)生發(fā)展[3]。軟骨細胞作為關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細胞，在OA發(fā)展中起關(guān)鍵作用，預(yù)防和治療OA的策略是抑制軟骨細胞降解和破骨細胞的生成[4]。

近年來，從傳統(tǒng)草藥植物中提取有效成分在退化性炎癥疾病的研究中引起了廣泛關(guān)注。七葉皂苷是從七葉樹種子中提取的三萜皂苷類化合物，七葉皂苷A（Escin A，EsA）是其主要的活性成分[5]。研究表明，七葉皂苷具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)免疫等作用，其中，抗炎特性可能與其抑制核因子-κB（NF-κB）活化和MAPK磷酸化有關(guān)，NF-κB信號通路在OA的病理過程中起著至關(guān)重要的作用，在OA的關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨中被激活，也是誘導(dǎo)各種促炎性細胞因子產(chǎn)生的基礎(chǔ)，包括白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）及聚蛋白多糖酶(ADAMTS5)等[6]。在骨科疾病中，七葉皂苷能夠促進脊髓損傷后修復(fù)，具體表現(xiàn)為減輕自由基的氧化損傷、縮小空洞的面積以及抑制炎癥細胞的活化與浸潤[7]。此外，七葉皂苷鈉對骨折后腫脹也具有良好的治療作用[8]。然而，有關(guān)EsA在OA中發(fā)揮的作用與相關(guān)機制的研究相對較少。本研究通過體內(nèi)與體外實驗研究EsA在OA中的作用，并對其內(nèi)在機制進行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性C57BL/6小鼠購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。將小鼠放在光照、黑暗12 h交替，溫度為20～25 ℃，相對濕度為45%～50%的動物飼養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，期間自由飲水和攝食。

1.2 主要試劑 EsA（≥98%，上海澤葉生物科技有限公司），IL-1β（美國PeproTech公司），胎牛血清、青霉素/鏈霉素和DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Sigma公司），ELISA試劑盒（上海碧云天生物研究所），RIPA裂解液、ECL顯色液及HE染色試劑盒（北京康為世紀生物公司），BCA蛋白試劑盒（上海羽朵生物科技有限公司），TRIzol試劑、Prime ScriptTMRT reagent試劑盒與SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒（日本Takara公司），免疫熒光染色試劑與番紅O固綠染液（北京索萊寶科技有限公司），抗體缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-2α、Collagen II、MMP-9、p65、p-p65、IkBα 與 β-actin（美國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.3 方法

1.3.1 小鼠原代軟骨細胞的培養(yǎng) 將8只7日齡C57BL/6小鼠通過腹膜內(nèi)注射過量戊巴比妥鈉處死，在無菌環(huán)境下分離取小鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨坪、股骨髁狀突及髕骨內(nèi)側(cè)透明軟骨組織，將其剪切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，加入0.1%II型膠原酶在37℃下消化3 h，以1 500 r/min離心3 min，棄去上清液，加入含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天更換一次培養(yǎng)基。當細胞密度達到80%～90%時，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 細胞活性測定 將對數(shù)生長期的軟骨細胞以1×104個/孔均勻鋪于96孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。使用含10 mg/LIL-1β及不同濃度（10、50、100 μmol/L）EsA處理細胞24 h和48 h，IL-1β組加含10 mg/LIL-1β的培養(yǎng)液培養(yǎng)，對照組不進行任何處理。每孔加10 μLCCK-8溶液，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，采用酶標儀在450 nm處檢測各組吸光度值。

1.3.3 ELISA檢測TNF-α和IL-6含量 將軟骨細胞使用含10 mg/L的IL-1β及不同濃度（10、50、100μmol/L）的EsA處理細胞48 h，IL-1β組細胞加入含10 mg/L IL-1β的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，對照組細胞正常培養(yǎng)48 h。收集各組細胞，在離心機中以12 000 r/min離心20 min，分離上清液，ELISA試劑盒檢測上清液中TNF-α和IL-6含量，用酶標儀檢測450 nm處吸光度值，計算各因子含量。

1.3.4 實時定量PCR 將軟骨細胞按1.3.3進行不同處理后收集各組細胞，使用TRIzol試劑提取軟骨細胞總RNA，采用NanoDrop 2000測定RNA濃度與純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模版，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒檢測各基因mRNA表達，以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 3 min（1個循環(huán)），95℃變性 15 s，60℃退火 15 s，72℃延伸40 s（42個循環(huán)）。采用2-△△Ct法計算各檢測目的基因mRNA表達。引物由上海生工生物公司合成，引物序列如下，MMP-13上游：5'-TTGTGGCGATTGCAGGTCT-3'，下游：5'-CGT CAGAAGAAACCGAAC-3'；ADAMTS5上 游：5'-GTCTCAGCATTGACCTCG-3'，下游：5'-AGGG AGTTCCATCTGCCA-3'；β-actin上游：5'-CCAA CTGGGACGACATGGA-3'，下游：5'-GTGGTGAAG CTGTAGCC-3'。

1.3.5 Western blotting 將軟骨細胞按1.3.3進行不同處理后收集各組細胞，加入RIPA裂解液，在冰上裂解15 min，離心機中以12 000 r/min離心30 min，取上清液檢測蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TBST緩沖液洗膜，在5%脫脂奶粉液中常溫封閉1 h，加入稀釋的一抗在4 ℃下孵育過夜。次日，TBST緩沖液清洗后，加二抗在室溫下孵育2 h。TBST緩沖液洗膜，滴加ECL發(fā)光試劑曝光，使用Quantity ONE軟件檢測各條帶灰度值。

1.3.6 免疫熒光染色 將軟骨細胞均勻鋪于含爬片的24孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，進行相應(yīng)處理后，用PBS洗滌，室溫下采用4%多聚甲醛固定15 min，0.1% Triton X-100通透處理5 min，10%山羊血清封閉細胞2 h。PBS洗滌，滴加兔多克隆抗體p65（1∶200），4℃孵育過夜。洗滌玻片，滴加Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG（1∶200）于室溫下孵育45 min，加DAPI避光孵育10 min，PBS清洗，封片。使用熒光顯微鏡進行觀察并拍照。

1.3.7 氧化應(yīng)激指標測定 將軟骨細胞按1.3.3進行不同處理后收集各組細胞，加入PBS清洗細胞，在4℃以12 000 r/min離心3 min，沉淀中加入細胞裂解液在冰上裂解15 min，超聲處理后將裂解液在4℃以12 000 r/min離心5 min，取上清液按照超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）及丙二醛（MDA）試劑盒說明進行測定。

1.3.8 小鼠OA模型構(gòu)建 將60只12周齡的C57BL/6雄性小鼠隨機分為4組（假手術(shù)組、OA組、OA+低劑量EsA組和OA+高劑量EsA組），每組15只，根據(jù)先前文獻[9]建立了小鼠OA模型。小鼠腹膜內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，75%乙醇消毒后，無菌環(huán)境下于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)約1 cm縱行切口，打開關(guān)節(jié)腔，切斷前交叉韌帶，逐層縫合傷口，術(shù)后連續(xù)4天肌內(nèi)注射氨芐青霉素，假手術(shù)組除不切斷外其他操作均相同。術(shù)后第2天，OA+低劑量EsA組、OA+高劑量EsA組小鼠分別按照5 mg/kg、10 mg/kg于腹膜注射EsA，每隔一天注射1次，持續(xù)6周。

1.3.9 骨密度測定 治療6周后，處死所有小鼠，取兩側(cè)股骨，剔除股骨周圍軟組織，采用美國LUNAR公司雙能X線骨密度測量儀檢測小鼠股骨近端的骨密度。

1.3.10 組織病理學分析 采集小鼠膝關(guān)節(jié)組織，將其置于4%多聚甲醛中固定24 h后，放入10%EDTA溶液（pH=8.0）中脫鈣1個月。組織使用梯度乙醇脫水后，進行石蠟包埋，并切成5 μm厚的切片，進行HE染色。切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，加蘇木精染色5 min，0.1%氨水中分色數(shù)秒鐘，放入伊紅染液中染色2 min，經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察軟骨區(qū)域組織病理形態(tài)學改變。

1.3.11 番紅O固綠染色 將組織切片常規(guī)脫蠟水化后，PBS沖洗。加入蘇木素染核3 min，流水下沖洗，鹽酸乙醇分化，流水沖洗后，滴加固綠染色5 min，接著加入1%乙酸固色。流水再次沖洗，滴加番紅O染色數(shù)秒，進行脫水、透明后，滴加中性樹膠進行封片，在光學顯微鏡下觀察圖像。

2 結(jié)果

2.1 EsA對IL-1β刺激的軟骨細胞存活率的影響與對照組比較，IL-1β刺激下細胞存活率顯著下降（P＜0.05）；經(jīng)10、50、100μmol/LEsA處理后24 h和48 h，細胞存活率均高于IL-1β組（P＜0.05），其中，在50 μmol/LEsA作用48 h細胞存活率最高，見表1。

表1 各組軟骨細胞存活率比較

2.2 EsA對IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響IL-1β誘導(dǎo)下TNF-α和IL-6含量較對照組顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β組比較，不同濃度EsA（10、50、100 μmol/L）作用均使TNF-α和IL-6含量顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組軟骨細胞上清液TNF-α和IL-6含量比較

2.3 EsA對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞外基質(zhì)合成及降解的影響 與對照組比較，IL-1β誘導(dǎo)下細胞中MMP-13和ADAMTS-5 mRNA表達顯著升高（P＜0.05）；在不同濃度 EsA（10、50、100 μmol/L）作用下，MMP-13和ADAMTS-5 mRNA表達較IL-1β 組顯著降低（P＜0.05），見表 3。IL-1β誘導(dǎo)下Collagen II蛋白表達顯著下降（P＜0.05），MMP-9蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；在不同濃度EsA（10、50、100 μmol/L）作用下，Collagen II蛋白表達升高，MMP-9蛋白表達降低（P＜0.05），見表3、圖1。

圖1 Western blotting檢測Collagen II與MMP-9蛋白表達

表3 各組軟骨細胞中MMP-13、ADAMTS-5 mRNA與Collagen II、MMP-9蛋白表達比較

2.4 EsA抑制了軟骨細胞中IL-1β誘導(dǎo)的HIF-2α與NF-κB信號通路激活 與對照組比較，IL-1β組p-p65、HIF-2α蛋白表達顯著升高，IκBα蛋白表達顯著下降（P＜0.05）；與IL-1β組比較，經(jīng)不同濃度EsA（10、50、100μmol/L）處理的細胞中IκBα蛋白表達顯著升高（P＜0.05），而 p-p65與HIF-2α的蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；p65蛋白在各處理組軟骨細胞中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4、圖2。

表4 各組軟骨細胞中p-p65、p65、IκBα與HIF-2α蛋白表達比較

圖2 Western blotting檢測p-p65、p65、IκBα與HIF-2α蛋白表達

與對照組比較，IL-1β刺激后細胞核顯示出高密度熒光，而細胞質(zhì)顯示出較少的熒光，表明p65被激活并且完成了核易位；與IL-1β組比較，使用50 μmol/LEsA處理細胞的細胞核熒光強度明顯下降，說明p65激活受到抑制，見圖3。

圖3 免疫熒光染色檢測細胞中p65表達

2.5 EsA對抗氧化標記物的影響 與對照組比較，軟骨細胞經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)后，MDA水平顯著升高（P＜0.05），SOD和CAT活性較對照組顯著下降（P＜0.05），而經(jīng)過不同濃度EsA（10、50、100 μmol/L）處理的細胞，MDA水平顯著下降，SOD和CAT活性顯著升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組軟骨細胞中SOD、CAT與MDA活性比較

2.6 EsA對OA小鼠骨密度的影響 與假手術(shù)組比較，OA組小鼠股骨骨密度值明顯降低（P＜0.05）；與OA組比較，OA+低劑量EsA組及OA+高劑量EsA組的骨密度值均明顯升高（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組小鼠骨密度檢測

2.7 EsA對OA小鼠膝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)變化的影響 假手術(shù)組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織未見明顯缺損，細胞排列整齊，番紅O染色正常；OA組軟骨破壞嚴重，細胞減少，番紅O著色較淺；在高、低劑量EsA作用下，小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨破壞得以改善，細胞數(shù)目增加，且在高劑量作用下改善更明顯，見圖6、圖7。

圖6 HE染色觀察各組小鼠膝關(guān)節(jié)組織病變

圖7 番紅O固綠染色觀察各組小鼠膝關(guān)節(jié)組織病變

3 討論

OA作為一種常見的致殘性關(guān)節(jié)疾病，其主要表現(xiàn)為軟骨細胞的行為學改變引起的軟骨退化[2]。OA反映了軟骨細胞基質(zhì)合成代謝與分解代謝過程之間的失衡，通?？烧{(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白如II型膠原蛋白的合成與分解代謝過程如MMP來維持軟骨重塑和修復(fù)，并通過含血小板結(jié)合蛋白基序的去整合素和金屬蛋白酶的ADAMTS來降解ECM以維持其平衡[10]。在OA期間，由于炎癥和代謝等因素相關(guān)的復(fù)雜機制，ECM的失衡可引起關(guān)節(jié)軟骨破裂、軟骨下骨損傷和滑膜發(fā)炎，最終致使滑膜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞[11-12]。

OA是由多種炎性因子介導(dǎo)的無菌性炎癥疾病[13]。研究表明，IL-1β在OA病程中起關(guān)鍵作用，能夠介導(dǎo)其他炎性因子的產(chǎn)生，刺激軟骨細胞合成和分泌MMPs，并抑制軟骨Ⅱ型膠原的表達[14]。而聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白的含量降低以及MMPs和促炎細胞因子的表達增加，都是OA的標志性特征[15]。本研究通過體外IL-1β 刺激軟骨細胞實驗觀察炎性因子TNF-α和IL-6含量，MMP-13和ADAMTS-5 mRNA的表達以及Collagen-II、MMP-9的蛋白水平，結(jié)果顯示EsA可抑制軟骨細胞中TNF-α和IL-6含量，下調(diào)MMP-13、ADAMTS-5mRNA和MMP-9蛋白表達水平，并上調(diào)Collagen-II蛋白表達水平。

NF-κB是與炎癥密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)一系列炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，這些介質(zhì)在OA過程中起著重要的作用[16]。在正常狀態(tài)下，NF-κB和IκB緊密結(jié)合在細胞質(zhì)中，在IL-1β刺激下IκB會降解，而磷酸化的NF-κB進入細胞核可誘導(dǎo)一些炎癥因子表達。因此，抑制NF-κB活化是治療炎性疾病的有效方法[17]。研究顯示，HIF-2α在OA軟骨中呈現(xiàn)高表達，并通過誘導(dǎo)基質(zhì)降解酶的表達而促進OA的發(fā)展[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)EsA可抑制NF-κB通路的激活。HIF-2α是OA過程中的分解代謝因子，可直接誘導(dǎo)分解因子在軟骨細胞中表達。IL-1β刺激的軟骨細胞中HIF-2α蛋白表達升高，而EsA可抑制HIF-2α蛋白表達。

在正常情況下，機體內(nèi)存在的抗氧化酶能夠清除體內(nèi)過量的氧自由基，從而維持氧化平衡狀態(tài)。SOD和CAT作為主要的抗氧化酶，在機體內(nèi)氧化與抗氧化平衡中起著重要作用[20-21]。MDA是機體過氧化最重要的產(chǎn)物之一，其水平升高標志著氧化應(yīng)激水平升高，能夠加劇細胞膜的損傷[22]。目前，氧化應(yīng)激反應(yīng)已成為OA研究領(lǐng)域的熱點，使用抗氧化劑能夠保護軟骨細胞免受活性氧損害[23]。本研究中，經(jīng)過EsA處理的細胞中MDA水平下降，而SOD和CAT活性均升高。說明EsA可能具有抗OA氧化應(yīng)激的作用。

為進一步說明EsA對OA進程的影響，本研究通過建立小鼠OA模型初步探究了EsA在機體內(nèi)的作用。目前，利用動物來制備OA模型以探究發(fā)病機制與防治措施，主要動物以兔、鼠居多。本研究選擇C57BL/6小鼠為造模對象，主要原因是：1）小鼠關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)與軟骨凋亡方式與人類關(guān)節(jié)相似；2）個體較小，操作方便；3）關(guān)節(jié)軟骨較小且相對脆弱，刺激后容易產(chǎn)生病理變化；4）該品系小鼠能夠自發(fā)產(chǎn)生類似膝骨OA的改變，已有多項研究使用C57BL/6小鼠來構(gòu)建OA模型進行實驗研究[24]。本實驗通過制備小鼠OA模型并給予七葉皂苷治療后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)低、高劑量EsA治療的OA小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨破壞均得到了明顯改善。結(jié)合上述體外研究結(jié)果，推測EsA對OA小鼠具有一定的治療作用，可能與其發(fā)揮的抗炎、抗氧化作用有關(guān)。在OA中關(guān)節(jié)局部骨密度水平是討論的熱點內(nèi)容，關(guān)于OA膝關(guān)節(jié)中骨密度變化檢測結(jié)果存在一定差別，但絕大數(shù)研究發(fā)現(xiàn)OA中膝關(guān)節(jié)局部如股骨內(nèi)側(cè)髁、脛骨內(nèi)外側(cè)的骨密度均是降低的，臨床研究結(jié)果也顯示，骨密度水平越低，疼痛癥狀越嚴重[25]。本研究結(jié)果也顯示，在OA小鼠中骨密度下降，而經(jīng)過EsA治療后股骨骨密度升高，進一步說明了EsA對OA具有治療作用。

綜上，本研究通過體內(nèi)、外實驗探討了EsA在小鼠軟骨細胞以及OA進程中的作用，表明EsA能夠通過抑制HIF-2α表達與NF-κB信號通路的活化，并且發(fā)揮抗氧化活性來抑制小鼠OA進展，由此表明EsA對治療OA具有一定的潛在作用，為后續(xù)研究奠定了實驗基礎(chǔ)。