吳 昊，閻紅琳，袁靜萍

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染引起的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)在全球范圍內(nèi)持續(xù)蔓延。根據(jù)血清型和基因組特點(diǎn)，冠狀病毒亞科被分為α、β、γ和δ四個(gè)屬，SARS-CoV-2是一種屬于β屬的新型冠狀病毒[1]。在某些病毒感染的細(xì)胞內(nèi)，用普通光鏡可看到大小和數(shù)量都不同的圓形或不規(guī)則小體，稱為病毒包涵體，可用特殊的病毒包涵體染色法明確有無(wú)病毒感染。筆者通過(guò)查閱資料使用改良亞甲基藍(lán)堿性品紅染色法顯示COVID-19肺組織中病毒包涵體，并經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)染色過(guò)程中對(duì)分化程度的掌握至關(guān)重要，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料在未充分認(rèn)識(shí)SARS-CoV-2病毒感染的疫情早期，有2例患者在武漢大學(xué)人民醫(yī)院接受了肺葉切除術(shù)，2例患者均在術(shù)后第1天顯示淋巴細(xì)胞降低，其中1例患者有輕微咳嗽。2例患者流感病毒及其他病毒(乙肝梅丙艾)檢測(cè)均呈陰性，分別于術(shù)后第4天和第6天經(jīng)核酸檢測(cè)確診為COVID-19?；仡櫺苑治龌颊咝g(shù)前CT示磨玻璃影的病毒性肺炎改變，推測(cè)2例患者在術(shù)前已感染SARS-CoV-2。因此收集2例患者剩余手術(shù)標(biāo)本，全部取材，經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、3 μm厚切片。石蠟組織切片SARS-CoV-2原位雜交檢測(cè)為陽(yáng)性，進(jìn)一步證實(shí)患者術(shù)前已感染SARS-CoV-2[2]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(WDRY2020-K005)。

1.2 方法采用改良亞甲基藍(lán)堿性品紅染色法標(biāo)記病毒包涵體：(1)選取同一組織蠟塊切片3張脫蠟至水；(2)在0.25%堿性品紅中染色25 min；(3)水洗；(4)根據(jù)檸檬酸分化時(shí)間長(zhǎng)短分為A、B、C三組。A組切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化4～6 min至切片無(wú)紅色殘留，B組切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化1.5～2.5 min至切片呈淺粉紅色，C組切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化20～30 s至切片呈淺紅色；(5)水洗；(6)分別用0.5%亞甲基藍(lán)復(fù)染10 s；(7)水洗；(8)風(fēng)干切片；(9)中性樹膠封固。

2 結(jié)果

A組切片全片皆為藍(lán)色背景，無(wú)紅色或紫紅色陽(yáng)性信號(hào)，不利于觀察病毒包涵體(圖1)；B組切片可見(jiàn)病毒包涵體位于細(xì)胞質(zhì)里，呈紫紅色，嗜酸性，周圍有空暈，其他背景為藍(lán)色，紅細(xì)胞或黏液的非特異性染色較少(圖2)；C組切片藍(lán)色背景下見(jiàn)大片紅細(xì)胞及纖維蛋白滲出物呈紅色非特異性染色，偶見(jiàn)細(xì)胞中類似于病毒性包涵體的染色，但與周圍紅細(xì)胞染色類似，不能區(qū)分是病毒包涵體還是紅細(xì)胞(圖3)。

①②③圖1 切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化4～6min 圖2 切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化1.5～2.5min(紅箭頭示病毒包涵體) 圖3 切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化20～30s(黑箭頭示紅細(xì)胞,紅箭頭示類似于紅細(xì)胞也類似于病毒包涵體)

3 討論

病毒顆粒較小，直徑10～30 nm，在電鏡下才能觀察，若想從病理技術(shù)角度較準(zhǔn)確的鑒定它，可在其侵入宿主細(xì)胞形成病毒包涵體后，應(yīng)用多種特殊染色方法顯示和確定。常用的病毒包涵體特殊染色方法：Mann亞甲藍(lán)伊紅染色法、改良亞甲基藍(lán)堿性品紅染色法、Lendrum玫瑰紅酒石酸染色法。比較三種特殊染色方法，改良亞甲基藍(lán)堿性品紅染色法比其他兩種染色方法耗時(shí)短(<1 h)，分化過(guò)程易掌握，包涵體清晰可見(jiàn)，層次分明，應(yīng)用較廣泛[3]。

傳統(tǒng)亞甲基藍(lán)堿性品紅染色法主要步驟：在梯度乙醇和蒸餾水中脫蠟和水化；0.25%堿性品紅染色30 min；0.5%檸檬酸分化3 s；自來(lái)水沖洗2 min；用1%甲基藍(lán)復(fù)染15～30 s；自來(lái)水沖洗；脫水，透明，封固。但在實(shí)際過(guò)程中由于標(biāo)本不同，各實(shí)驗(yàn)室條件存在差異，本實(shí)驗(yàn)對(duì)以上步驟各環(huán)節(jié)均進(jìn)行了摸索，探索出一種適合本科室的實(shí)驗(yàn)步驟。

首先，用改良亞甲基藍(lán)堿性品紅染色法顯示COVID-19肺組織中病毒包涵體，嚴(yán)格控制分化程度。分化時(shí)間過(guò)久，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及纖維結(jié)締組織等均呈無(wú)色，病毒包涵體的著色也被分化掉，亞甲基藍(lán)復(fù)染后全部顯示為藍(lán)色，不利于病毒包涵體的顯色；分化時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及纖維蛋白滲出物等均呈紅色，亞甲基藍(lán)復(fù)染后紅細(xì)胞及纖維蛋白滲出物仍顯示紅色，造成染色層次不分明，同樣不利于病毒包涵體的顯色。筆者經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)，將在光鏡下對(duì)分化的微觀控制轉(zhuǎn)化為宏觀的切片在白色襯底下的顏色控制(紅→淺紅→淺粉→無(wú)色)，并考慮了組織大小等因素，從而記錄了各種分化程度所需要的時(shí)間：切片從紅色到淺紅色分化時(shí)間為20～30 s；切片從淺紅到淺粉的分化時(shí)間為1.5～2.5 min；切片從淺粉到無(wú)色的分化時(shí)間為4～6 min，因此本文根據(jù)以上經(jīng)驗(yàn)將檸檬酸分化時(shí)間長(zhǎng)短分為A、B、C三組：A組分化4～6 min，切片無(wú)紅色殘留；B組分化1.5～2.5 min，切片呈淺粉紅色；C組分化20～30 s，切片呈淺紅色，并觀測(cè)到分化1.5～2.5 min的效果更好，既有陽(yáng)性結(jié)果，又減少了紅細(xì)胞及黏液的非特異性染色。

其次，實(shí)驗(yàn)初查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)該特殊染色方法顯示病毒包涵體多用甲基藍(lán)復(fù)染，但由于當(dāng)時(shí)武漢市緊張的抗疫大環(huán)境，本科室暫時(shí)無(wú)法購(gòu)買甲基藍(lán)試劑，決定使用亞甲基藍(lán)復(fù)染，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)觀察，也可得到較好的對(duì)比效果，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

再次，染色結(jié)束后考慮到后續(xù)脫水透明步驟可能有脫色作用，因此省去了切片后續(xù)的脫水透明步驟。通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)完全依據(jù)參考文獻(xiàn)的操作步驟，并不能得到較理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室條件(如組織標(biāo)本的固定脫水等流程、實(shí)驗(yàn)室擁有的試劑藥品、實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度等)，在已查閱的染色理論指導(dǎo)下，應(yīng)用控制變量等實(shí)驗(yàn)方法，反復(fù)摸索出適合本實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)染色流程。本科室總結(jié)得出，用改良亞甲基藍(lán)堿性品紅染色法顯示病毒包涵體的實(shí)驗(yàn)步驟：3 μm厚切片脫蠟至水，0.25%堿性品紅染色25 min，水洗，切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化1.5～2.5 min，切片呈淺粉紅色，水洗，1%亞甲基藍(lán)復(fù)染10 s，水洗，風(fēng)干中性樹膠封固。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)使用改良亞甲基藍(lán)堿性品紅染色法可以較好地顯示病毒包涵體，有利于病理工作者從病理技術(shù)的角度證實(shí)COVID-19肺組織中病毒的存在，為臨床治療和診斷提供有力支持。