杜春平，莫穎禧，曾麗霞，陳肖瑜，羅文奇，黃 靜，馬 韻

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，包含多種病理類型，其中甲狀癌乳頭狀癌是最常見的類型[1-2]。紡錘體與著絲粒相關(guān)蛋白3(spindle and kinetochore associated protein 3, SKA3)參與介導(dǎo)動(dòng)粒與微管的相互作用，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡。SKA3在腫瘤中過(guò)表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞增殖和患者預(yù)后有關(guān)[3-4]。目前尚無(wú)SKA3在甲狀腺癌中的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化和多個(gè)甲狀腺乳頭狀癌研究隊(duì)列的大數(shù)據(jù)，分析SKA3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)、預(yù)后及其分子意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年6月～2020年4月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院存檔的行根治術(shù)的甲狀腺組織標(biāo)本，包括21例甲狀腺乳頭狀癌和16例正常甲狀腺組織。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化免疫組化染色采用SP法檢測(cè)系統(tǒng)(北京中杉金橋公司，SP-9000)，SKA3抗體(Bioss公司，1 ∶800稀釋，bs-7848R)。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作，EDTA抗原修復(fù)液修復(fù)。結(jié)果判讀：著色強(qiáng)度呈淺黃色為1分，黃色為2分，黃褐色為3分，無(wú)陽(yáng)性著色為0分；陽(yáng)性細(xì)胞比例<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。上述兩項(xiàng)結(jié)果乘積作為SKA3最終表達(dá)結(jié)果。分析人類蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜(https://www.proteinatlas.org)中SKA3抗體(HPA039272)在20種腫瘤組織切片中的陽(yáng)性率。

1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源甲狀腺乳頭狀癌隊(duì)列分別來(lái)自基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus, GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)的GSE3467隊(duì)列和GSE33630隊(duì)列；癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov)的THCA隊(duì)列。GSE3467和GSE33630隊(duì)列的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)分別包含17例(腫瘤7例、配對(duì)正常標(biāo)本7例)和90例(腫瘤45例、配對(duì)對(duì)照標(biāo)本45例)。THCA隊(duì)列的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)包含572例樣本(腫瘤513例、對(duì)照標(biāo)本59例)。

1.3 數(shù)據(jù)分析GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)軟件分析SKA3 mRNA在GSE3467隊(duì)列和GSE33630隊(duì)列中的表達(dá)。UCSC Xena(https://xenabrowser.net)軟件分析SKA3 mRNA在THCA隊(duì)列中的表達(dá)。R軟件(https://www.r-project.org)分析THCA隊(duì)列的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選與SKA3相關(guān)的差異表達(dá)基因。R軟件對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體論(Gene ontology, GO)富集分析。TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer)軟件分析THCA隊(duì)列中腫瘤組織的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，分析SKA3與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。t檢驗(yàn)和ROC曲線分析SKA3蛋白表達(dá)，用平均數(shù)表示。秩和檢驗(yàn)分析SKA3 mRNA表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系，用中位數(shù)表示。以SKA3 mRNA中位數(shù)為參照，分為低表達(dá)組和高表達(dá)組；Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)比較SKA3低、高表達(dá)組間的預(yù)后。皮爾森相關(guān)檢驗(yàn)篩選SKA3相關(guān)的差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：P<0.05，r>0.4或<-0.4。皮爾森χ2檢驗(yàn)分析SKA3與免疫細(xì)胞的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 癌組織中SKA3蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示(圖1)，與正常甲狀腺組織(1.375±0.154 8)相比，SKA3蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織(5.857±0.448 7)中的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001，圖2)。ROC曲線示，SKA3具較高的診斷價(jià)值(AUC=0.981，圖3)。SKA3在甲狀腺乳頭狀組織中的陽(yáng)性率高于其他腫瘤(圖4)。

AB

圖2 散點(diǎn)圖分析SKA3蛋白在正常組織和甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)

圖3 ROC曲線顯示SKA3在甲狀腺乳頭狀癌中的特異性和敏感性

圖4 SKA3在20種腫瘤組織中的陽(yáng)性率比較

2.2 癌組織中SKA3 mRNA的表達(dá)應(yīng)用3個(gè)甲狀腺乳頭狀癌隊(duì)列，合計(jì)565例甲狀腺乳頭狀癌組織和111例對(duì)照組織，分析SKA3 mRNA的差異表達(dá)。與正常甲狀腺組織(GSE3467：5.783；GSE33630：5.166；THCA：2.555)相比，SKA3 mRNA在3個(gè)甲狀腺乳頭狀癌隊(duì)列中的表達(dá)均上調(diào)(GSE3467：6.012，P<0.001；GSE33630：5.530，P<0.001；THCA：3.792，P<0.001)(圖5)。

圖5 SKA3 mRNA在正常組織和癌組織的差異表達(dá)：A.GSE3467隊(duì)列；B.GSE33630隊(duì)列；C.THCA隊(duì)列

2.3 SKA3與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系THCA隊(duì)列用于SKA3 mRNA與患者臨床病理特征的分析，SKA3在N1期(3.981)的表達(dá)水平高于N0期(3.630)(P<0.001，圖6)。SKA3在性別(P=0.626)、年齡(P=0.623)、病理分期(P=0.428)、T分期(P=0.707)、M分期(P=0.084)中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SKA3高表達(dá)組的無(wú)瘤生存期(P=0.003)和無(wú)進(jìn)展生存期(P=0.017)均低于低表達(dá)組(圖7)；但在總生存率(P=0.393)和疾病特異生存率(P=0.741)方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 SKA3 mRNA在N分期中的表達(dá)分析

圖7 SKA3表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后的關(guān)系：A.無(wú)瘤生存期；B.無(wú)進(jìn)展生存期

2.4 SKA3共表達(dá)基因及其功能生物信息學(xué)篩選獲得與SKA3的共表達(dá)基因532個(gè)，其中正相關(guān)者有506個(gè)(P<0.05，r>0.4)，負(fù)相關(guān)者有26個(gè)(P<0.05，r<-0.4)。GO分析顯示，這些基因參與的生物學(xué)過(guò)程主要是：細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、DNA損傷檢查點(diǎn)、腫瘤壞死因子的產(chǎn)生、MAP激酶活性的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞遷移、淋巴細(xì)胞遷移、淋巴細(xì)胞聚集、中性粒細(xì)胞遷移等。

2.5 SKA3與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系TIME軟件分析顯示，SKA3與B細(xì)胞(P<0.001，r=0.415)、CD8+T細(xì)胞(P<0.001，r=0.255)、CD4+T細(xì)胞(P<0.001，r=0.271)、巨噬細(xì)胞(P<0.001，r=0.244)、中性粒細(xì)胞(P<0.001，r=0.426)和樹突狀細(xì)胞(P<0.001，r=0.51)的浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用4個(gè)獨(dú)立的甲狀腺乳頭狀癌隊(duì)列，比較SKA3在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)水平。SKA3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)顯著上調(diào)，具有一定的診斷價(jià)值。甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，是腫瘤高復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素[5]。SKA3在N1期患者中的表達(dá)水平顯著高于N0期患者，提示SKA3高表達(dá)可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)。SKA3高表達(dá)組患者的無(wú)瘤生存期和無(wú)進(jìn)展生存期低于低表達(dá)組，提示SKA3高表達(dá)患者的預(yù)后更差。綜上所述，SKA3表達(dá)上調(diào)可能與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生和預(yù)后有關(guān)。

GO分析顯示多種生物過(guò)程可能與SKA3基因有關(guān)，如細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)等。SKA3是紡錘體與著絲粒相關(guān)蛋白復(fù)合體的重要亞基，與NDC80復(fù)合物共同控制和調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂，對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡有調(diào)節(jié)作用[6]。GO分析還發(fā)現(xiàn)SKA3可能與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SKA3與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)。腫瘤組織周圍活化的免疫細(xì)胞可通過(guò)分泌促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[7]。甲狀腺癌中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)水平與免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子的分泌升高相關(guān)[8]。SKA3高表達(dá)患者的腫瘤免疫細(xì)胞增多，可能是影響其惡性生物行為，腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞受宿主免疫狀態(tài)的影響，可被藥物有效靶向，并與免疫治療的臨床療效相關(guān)[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SKA3對(duì)甲狀腺乳頭狀癌可能具有一定的影響，可能作為預(yù)后和治療的標(biāo)志物。