劉 謙，袁 晟，劉 勇

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是淋巴瘤中最常見的類型之一。據(jù)國內(nèi)一項大型多中心研究顯示，DLBCL是我國人群中最常見的淋巴瘤類型，占所有淋巴瘤的33.27%[1]。氧化應(yīng)激在腫瘤、炎癥、創(chuàng)傷、缺血再灌注等很多疾病狀態(tài)或病理狀態(tài)下出現(xiàn)。有研究者應(yīng)用一系列氧化應(yīng)激標(biāo)志物和抗氧化物酶首先證實了侵襲性霍奇金淋巴瘤中存在氧化應(yīng)激現(xiàn)象[2]。而過氧化物酶(peroxiredoxin, Prdx)作為一類新發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶蛋白家族，廣泛存在于原核和真核生物中，對生物體內(nèi)的活性氧具有重要清除作用[3]。Prdx6是Prdx家族中唯一屬于1-半胱氨酸(1-cysteine, 1-Cys)亞類的成員，盡管其在蛋白構(gòu)成上與家族其它成員具有同源性，但在功能特點上表現(xiàn)出明顯的不同[4]。隨著研究的深入，Prdx6在腫瘤尤其是淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展，以及在腫瘤侵襲過程中的作用也被不斷發(fā)現(xiàn)[5-7]。因此，本實驗采用免疫組化法檢測Prdx6在DLBCL中的表達(dá)，探討其與臨床病理特征及患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集江西省人民醫(yī)院2015～2017年診斷的286例DLBCL作為研究對象，根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、實驗室檢查等進(jìn)行臨床資料分組。按照Hans分型將DLBCL分為生發(fā)中心(germinal center B-cell like, GCB)組和非生發(fā)中心(non-germinal center B-cell like, non-GCB)組。根據(jù)免疫組化BCL-2(≥50%)和C-MYC(≥40%)的表達(dá)情況，篩選出病例中的雙表達(dá)。根據(jù)DLBCL類型分為特指型和非特指型，其中特指包括原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(primary diffuse large B-cell lymphoma of CNS, PCNSL)、原發(fā)縱隔(胸腺)大B細(xì)胞淋巴瘤[primary mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma, PMBL]、EB病毒陽性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(EBV-positive diffuse large B-cell lymphoma, EBV+DLBCL)，富于T細(xì)胞/組織細(xì)胞大B細(xì)胞淋巴瘤(T-cell/histiocyte-rich large B-cell lymphoma, THRLBCL)；以及彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤，非特指型。同時，收集30例正常淋巴結(jié)作為對照。在有隨訪資料的124例患者中，死亡28例，隨訪時間1～57個月。

1.2 方法Prdx6兔抗人單克隆抗體(ab133348，Abcam公司，稀釋度1 ∶300)。所有組織均使用10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，行常規(guī)HE染色和免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision兩步法。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)Prdx6陽性定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。陽性結(jié)果針對腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評估：(1)弱陽性(僅在40倍物鏡下可見)；(2)中等強(qiáng)度陽性(在20倍物鏡下可見)；(3)強(qiáng)陽性(在10倍物鏡下可見)，且只有100%細(xì)胞顯示強(qiáng)陽性才納入強(qiáng)陽性組[7]。在臨床和病理資料雙盲條件下由兩名病理學(xué)專家進(jìn)行閱片評分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用IBM SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗分析Prdx6蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。生存率的統(tǒng)計采用Kaplan-Meier生存分析(組間比較采用Log-rank檢驗)和Cox多因素回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL與正常淋巴結(jié)中Prdx6的表達(dá)在286例DLBCL中，Prdx6陽性196例，在30例正常淋巴結(jié)中，Prdx6陽性9例。Prdx6在DLBCL中的表達(dá)高于正常淋巴結(jié)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=17.69，P<0.001，表1)。

表1 DLBCL及正常淋巴結(jié)中Prdx6的表達(dá)

2.2 DLBCL中Prdx6表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系DLBCL中Prdx6表達(dá)與患者性別、年齡(<60歲和≥60歲)、有無B癥狀、LDH水平、Hans分型、有無雙表達(dá)、腫瘤分期及組織學(xué)類型進(jìn)行比較，其中Prdx6在Hans分型中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.771，P<0.001)；而在性別、年齡、有無B癥狀、LDH水平、有無雙表達(dá)、腫瘤分期及組織學(xué)類型的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 Prdx6表達(dá)與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系

2.3 DLBCL中Prdx6表達(dá)強(qiáng)度與臨床病理特征的關(guān)系在286例DLBCL中，Prdx6陰性90例(圖1)；不同程度陽性196例，其中弱～中等陽性89例(圖2)，占陽性病例的45.4%，強(qiáng)陽性107例(圖3)，占陽性病例的54.6%。其中，Prdx6在具有B癥狀組和LDH升高組中的陽性程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.872，P=0.027；χ2=5.965，P=0.015)，而在患者性別、年齡、Hans分型、有無雙表達(dá)、腫瘤分期及組織學(xué)類型的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表3)。

①②③圖1 DLBCL中Prdx6陰性,EnVision兩步法圖2 DLBCL中Prdx6弱～中等陽性,EnVision兩步法圖3 DLBCL中Prdx6強(qiáng)陽性,EnVision兩步法

圖4 Prdx6表達(dá)與DLBCL患者生存的關(guān)系

表4 Cox多因素回歸分析

2.4 生存分析124例有隨訪資料的DLBCL患者平均生存時間為46.3個月。按照Prdx6免疫組化表達(dá)強(qiáng)度劃分，陰性、弱～中等陽性和強(qiáng)陽性病例分別為37、43、44例。在37例Prdx6陰性病例中，PCNSL.原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；PMBL.原發(fā)縱隔(胸腺)大B細(xì)胞淋巴瘤；EBV+DLBCL.EB病毒陽性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；THRLBCL.富于T細(xì)胞/組織細(xì)胞大B細(xì)胞淋巴瘤5例因疾病死亡，32例生存；43例Prdx6弱～中等陽性病例中，8例因疾病死亡，35例生存；44例Prdx6強(qiáng)陽性病例中，15例因疾病死亡，29例生存。Prdx6表達(dá)與預(yù)后分析顯示，Prdx6陰性、弱～中等陽性和強(qiáng)陽性患者的生存差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.308，P=0.01)。進(jìn)一步統(tǒng)計分析顯示，Prdx6強(qiáng)陽性組患者預(yù)后比陰性組患者的預(yù)后差(χ2=6.998，P=0.008，圖4)。Cox多因素回歸模型分析顯示，只有腫瘤分期(RR=3.412，95%CI=1.245～9.348，P=0.017，表4)是影響患者生存的危險因素。

3 討論

DLBCL作為最常見的淋巴瘤，由于其具有侵襲性生物學(xué)行為，患者預(yù)后常常較差。雖然有研究針對免疫化學(xué)治療和預(yù)后標(biāo)志物篩選[8-9]，且在一定程度上能夠延長部分DLBCL患者的生存期，并為后續(xù)治療帶來新希望，但仍會出現(xiàn)部分復(fù)發(fā)難治和耐藥患者。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)作為生物體內(nèi)正常有氧代謝的產(chǎn)物，能在生理和病理過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)。隨著ROS大量產(chǎn)生，氧化應(yīng)激也隨之產(chǎn)生，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起至關(guān)重要的作用[10-11]。Prdx是一類抗氧化酶蛋白家族，在生物體內(nèi)對ROS的清除具有重要作用。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)Prdx家族有6個成員(1～6)，其同工酶可以出現(xiàn)在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)PCNSL.原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；PMBL.原發(fā)縱隔(胸腺)大B細(xì)胞淋巴瘤；EBV+DLBCL.EB病毒陽性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；THRLBCL.富于T細(xì)胞/組織細(xì)胞大B細(xì)胞淋巴瘤；*Fisher確切概率法網(wǎng)和過氧化物酶體中[11]。根據(jù)Cys殘基數(shù)目的不同，使得Prdx6的功能有別于家族其它5個成員[12]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Prdx6在部分腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲上具有一定作用，與尿激酶和受體激活途徑、谷胱甘肽過氧化物酶的增加有一定關(guān)聯(lián)[13-15]。然而，Prdx6在淋巴瘤中的生物學(xué)行為還處于未知狀態(tài)[10]。

表3 Prdx6陽性強(qiáng)度與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系

本組結(jié)果顯示，Prdx6在DLBCL中的表達(dá)顯著高于正常淋巴結(jié)。近期Kari等[16]發(fā)現(xiàn)：Prdx6在正常人血清中的表達(dá)高于DLBCL，其研究中并未涉及Prdx6在正常淋巴結(jié)中的表達(dá)情況。因此，Prdx6在正常人血清中高表達(dá)與淋巴結(jié)中的低表達(dá)是否存在關(guān)系，有待更多研究加以證實。通過Hans分型將DLBCL分為GCB組和non-GCB組，統(tǒng)計結(jié)果顯示Prdx6在non-GCB組中的表達(dá)明顯高于GCB組，說明Prdx6表達(dá)可能與生發(fā)中心后來源的腫瘤細(xì)胞有關(guān)。另外，在Prdx6陽性病例中，出現(xiàn)B癥狀病例的陽性強(qiáng)度明顯高于無B癥狀病例，提示Prdx6表達(dá)強(qiáng)度可能與DLBCL所引起的全身癥狀(如發(fā)熱、盜汗、體重減輕和皮疹等)有關(guān)。LDH作為評價淋巴瘤預(yù)后的主要指標(biāo)之一，對淋巴瘤的監(jiān)測和評估具有重要作用，其同工酶LDH-5升高更是被認(rèn)為與非霍奇金淋巴瘤的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸有關(guān)[17]。本實驗結(jié)果提示，在LDH升高病例中的Prdx6陽性強(qiáng)度高于LDH正常病例，說明LDH升高與Prdx6陽性強(qiáng)度有一定關(guān)系。

本實驗主要目的是評估Prdx6異常表達(dá)與DLBCL預(yù)后的相關(guān)性，從生存分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)Prdx6陽性程度越高，患者預(yù)后越差。在具有隨訪資料的病例中，Prdx6陰性和弱～中等陽性組的病死率分別為13.5%和18.6%，而強(qiáng)陽性組的病死率為34.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Prdx6陰性和弱～中等陽性組間的生存率雖然有一定差異，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另外，Kuusisto等[7]研究發(fā)現(xiàn)Prdx6在DLBCL反應(yīng)性T細(xì)胞胞質(zhì)中強(qiáng)陽性，患者預(yù)后會更好，提示可能是一種自身保護(hù)作用所致。

有研究證實，F(xiàn)as/FasL凋亡途徑是B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生的重要機(jī)制[18-19]，一旦Fas/FasL凋亡途徑不能正常發(fā)生，就會導(dǎo)致B細(xì)胞大量增殖，最終形成B細(xì)胞淋巴瘤。一些拮抗Fas/FasL凋亡途徑的分子通過抑制Caspases活性來阻斷凋亡通路[20-21]，其中Caspase-8是凋亡信號通路的啟動型Caspase，有研究已證實Prdx6是Caspase-8活性的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[22]。那么，在DLBCL的發(fā)生過程中，Prdx6表達(dá)是否通過拮抗Fas/FasL途徑而發(fā)揮作用，將有待我們進(jìn)一步研究證實。