鄭 炎，肖大樹(shù)，朱 楠，李文清，曹立宇

近年乳腺癌的發(fā)病出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)且病死率較高，大多數(shù)病例發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期[1]。如何治療乳腺癌，有效評(píng)估療效，正確評(píng)價(jià)預(yù)后已受到廣泛關(guān)注。乳腺癌的進(jìn)程復(fù)雜，有多種分子及多條信號(hào)通路參與其中。大多數(shù)乳腺癌患者接受各種形式的新輔助治療或輔助治療，以減少?gòu)?fù)發(fā)和提高總生存率，但療效并不令人滿意。因此，尋找新的預(yù)后標(biāo)志物將有助于更好地應(yīng)對(duì)這一難題，并有助于治療決策[2]。研究表明，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路在大多數(shù)人類癌癥中起調(diào)節(jié)作用。β-catenin主要通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移方面起到作用。Wnt信號(hào)異常激活常導(dǎo)致β-catenin核的積累[3]，入核的β-catenin會(huì)激活T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子并形成復(fù)合體，觸發(fā)下游靶基因的異常表達(dá)作用于細(xì)胞，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Wnt信號(hào)通路的異?；罨瘏⑴c腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程[4]。目前，關(guān)于Wnt/β-catenin信號(hào)通路在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的研究較少，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性癌、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌以及乳腺正常組織中β-catenin蛋白的表達(dá)，探討其在乳腺癌生物學(xué)行為判斷和預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年1月～2020年8月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院病理科存檔的149例乳腺組織標(biāo)本，其中正常乳腺組織30例，乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌33例，乳腺浸潤(rùn)性癌86例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例均經(jīng)病理學(xué)診斷，由2名病理醫(yī)師對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，以病理結(jié)果作為診斷依據(jù)；(2)具有完整的臨床病理資料和輔助檢查資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在嚴(yán)重的心、肺、肝、腎功能異常病史；(2)患者在接受檢查前進(jìn)行過(guò)相關(guān)醫(yī)學(xué)治療(如放療或化療等)。

1.2 主要試劑與儀器β-catenin鼠單克隆抗體(MX043，福州邁新公司)，EDTA抗原修復(fù)液(pH 9.0，MVS-0099)，PBS緩沖液(PBS-0060，pH 7.4～7.6)和MaxVision檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 免疫組化石蠟切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2孵育20 min，PBS沖洗，直接煮沸EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS沖洗3次；阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫下孵育10 min，滴加一抗孵育60 min，加入100 μL酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物Ⅲ室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次；DAB顯色；自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水封片，鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。β-catenin在正常組織細(xì)胞膜連續(xù)著色，癌組織中為胞質(zhì)、胞核異常著色。染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)分別從胞膜、胞質(zhì)和胞核判定，胞膜陽(yáng)性>70%為正常表達(dá)，否則為表達(dá)減少；胞質(zhì)或胞核陽(yáng)性>10%為異位表達(dá)；異位表達(dá)與表達(dá)減少均為異常表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析計(jì)數(shù)資料，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺組織中β-catenin蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，β-catenin在正常乳腺組織細(xì)胞胞膜表達(dá)，在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌及乳腺浸潤(rùn)性癌細(xì)胞胞膜的表達(dá)不同程度減少，而在胞質(zhì)和胞核中存在異常表達(dá)(圖1)。

2.2 正常乳腺、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌和乳腺浸潤(rùn)性癌中β-catenin的表達(dá)β-catenin在86例乳腺浸潤(rùn)性癌中的異常表達(dá)率為66.2%(57/86)，在正常乳腺組織中的異常表達(dá)率為6.7%(2/30)，在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織中的異常表達(dá)率為24.2%(8/33)。與正常乳腺組織相比，乳腺浸潤(rùn)性癌中的β-catenin異常表達(dá)率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 乳腺浸潤(rùn)性癌中β-catenin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系本組β-catenin表達(dá)在患者年齡、腫瘤直徑及Ki-67增殖指數(shù)方面，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)；病理分級(jí)Ⅰ級(jí)的β-catenin異常表達(dá)率26.7%，Ⅱ級(jí)為61.8%，Ⅲ級(jí)為89.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期β-catenin的異常表達(dá)率48%，Ⅲ+Ⅳ期為88.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的β-catenin異常表達(dá)率為51%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為86.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在E-cadherin有無(wú)異常表達(dá)、HER-2擴(kuò)增情況方面，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 乳腺浸潤(rùn)性癌中β-catenin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討論

本實(shí)驗(yàn)探討了β-catenin在正常乳腺組織、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌及乳腺浸潤(rùn)性癌中的表達(dá)，同時(shí)分析β-catenin表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示β-catenin在正常乳腺組織胞膜陽(yáng)性，在浸潤(rùn)性癌中陽(yáng)性部位轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)與胞核中，胞膜陽(yáng)性會(huì)減少。乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中β-catenin異常表達(dá)也明顯增高，苗玉等[5]對(duì)200例乳腺標(biāo)本進(jìn)行研究，在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織中發(fā)現(xiàn)β-catenin異常表達(dá)，且與其附近的原位和侵襲性成分中β-catenin表達(dá)模式高度一致，這也提示β-catenin異常表達(dá)可能在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌與乳腺浸潤(rùn)性癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起一定作用，具體的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究及證實(shí)。另外，乳腺浸潤(rùn)性癌中，病理分級(jí)Ⅰ級(jí)的β-catenin異常表達(dá)率低于Ⅱ、Ⅲ級(jí)，在臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、E-cadherin有無(wú)異常表達(dá)、HER-2擴(kuò)增情況組間，β-catenin異常表達(dá)率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

ABCDEF

β-catenin作為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，可協(xié)助E-cadherin共同作用，保持組織結(jié)構(gòu)的完整性與極性。胞膜上β-catenin表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致E-cadherin依賴性的細(xì)胞黏附力降低，癌細(xì)胞易從原發(fā)部位發(fā)生脫離。β-catenin及E-cadherin共同參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，使上皮細(xì)胞失去黏合性和極性，強(qiáng)化了轉(zhuǎn)移和侵襲能力[4]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明β-catenin及E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在生物機(jī)體進(jìn)入、調(diào)控細(xì)胞增殖分離、極化、凋亡和抗凋亡等過(guò)程中作用顯著，包括癌癥在內(nèi)的多種疾病和通路的異常相關(guān)[6]。有研究證明在食管癌[4]、涎腺癌[7]、非小細(xì)胞肺癌[8]、分化型甲狀腺癌[9]及口腔鱗狀細(xì)胞癌中[10]，β-catenin陽(yáng)性顆粒均主要異常表達(dá)于胞質(zhì)與胞核中。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，β-catenin在正常乳腺組織中呈胞膜陽(yáng)性，癌組織中胞膜表達(dá)減少，陽(yáng)性顆粒定位于胞質(zhì)、胞核。其機(jī)制可能是Wnt通路參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，當(dāng)異常情況下Wnt通路被激活，β-catenin由胞膜轉(zhuǎn)移到胞核內(nèi)，失去介導(dǎo)細(xì)胞間鏈接、黏附的作用，促使其下游轉(zhuǎn)錄因子也被激活并引起某些癌基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞癌變[11]。

β-catenin的表達(dá)作用目前已在不同種類癌癥的研究中逐步證實(shí)。Su等[12]報(bào)道，甲狀腺癌中通過(guò)β-catenin從胞膜到胞質(zhì)的移位，胞質(zhì)中β-catenin蛋白增加，從而激活Wnt通路。高薔等[13]研究表明，子宮頸癌中β-catenin表達(dá)異常，促進(jìn)子宮頸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移，可能提示患者預(yù)后不良。本組86例乳腺浸潤(rùn)性癌中，β-catenin異常表達(dá)率為66.2%(57/86)，在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織中的表達(dá)率為24.2%(8/33)，而在正常組織中的異常表達(dá)率為6.7%(2/30)，提示β-catenin異常表達(dá)上調(diào)可能在乳腺浸潤(rùn)性癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起一定作用。另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)33例乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織中8例存在β-catenin異常表達(dá)，提示其具備成為乳腺浸潤(rùn)性癌過(guò)渡階段診斷標(biāo)志物的可能性。

鑒于β-catenin在乳腺浸潤(rùn)性癌組織存在異常表達(dá)，近期有研究進(jìn)一步探究了β-catenin蛋白表達(dá)與腫瘤臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性和差異性。β-catenin在臨床分期、病理分化及淋巴結(jié)有否轉(zhuǎn)移的子宮頸癌[13]及喉癌中的表達(dá)有差異。不同腫瘤中β-catenin表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系存在差異，在非小細(xì)胞肺癌組織中，β-catenin表達(dá)與分化、轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)[14]，但邵宇鑫等[9]研究表明β-catenin在分化型甲狀腺癌中的異常表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但和臨床分期無(wú)顯著相關(guān)性。Zhang等[15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出，乳腺癌組織中β-catenin異位表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、臨床分期及Ki-67增殖指數(shù)有關(guān)。本組β-catenin表達(dá)與Ki-67增殖指數(shù)、腫塊大小及患者年齡無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，但在病理分級(jí)Ⅱ級(jí)(61.8%)和Ⅲ級(jí)的β-catenin異常表達(dá)率(89.2%)高于Ⅰ級(jí)組織(26.7%)，且與臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、E-cadherin有無(wú)異常表達(dá)及HER-2有無(wú)擴(kuò)增方面存在關(guān)聯(lián)，其中的差異性機(jī)制有待于進(jìn)一步觀察。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-catenin異常聚集與表達(dá)引發(fā)的細(xì)胞增殖和分化功能失常，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變，這種變化影響了乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。此發(fā)現(xiàn)可能有助于確定并開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)，以減少乳腺癌中β-catenin介導(dǎo)的惡性腫瘤，從而開(kāi)發(fā)新的治療策略。