武 艷，吳正升

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡日趨年輕化[1]。目前，尚無有效的治療方法控制乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[2]。因此，探索乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的新機(jī)制，改善患者的預(yù)后至關(guān)重要。U2AF同源基序激酶1(U2AF homologous kinase 1, UHMK1)被證明可以與一系列蛋白結(jié)合，如eEF1A、FAM64、CDKI、p27KIP1、SF3b155和CPEB1，表明UHMK1在不同的細(xì)胞過程中發(fā)揮不同作用[3-4]。更重要的是，相關(guān)研究表明UHMK1表達(dá)異常與胰腺癌、卵巢癌及胃癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[5-7]。目前，關(guān)于UHMK1對(duì)乳腺癌的影響在國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究中尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)使用shRNA干擾乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中UHMK1的表達(dá)，分析UHMK1對(duì)乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的影響，為進(jìn)一步明確乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和人胚胎腎細(xì)胞系293T均由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)朱濤教授惠贈(zèng)；Leibovitz’s-L15培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)(美國(guó)GIBCO公司)；0.25%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)和蛋白裂解液(碧云天生物公司)；Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)；兔抗人UHMK1抗體、鼠抗人Actin抗體(武漢三鷹生物公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑(全式金生物公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7采用含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的Leibovitz’s -L15培養(yǎng)基在37 ℃、無CO2條件下培養(yǎng)。人胚胎腎細(xì)胞系293T采用含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、含有5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.3 UHMK1-shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則，靶向設(shè)計(jì)UHMK1的shRNA，UHMK1-shRNA#1：5′-CCGGGAGTGCAGAGAATGAATG TTTCTCGAGAAACATTCATTCTCTGCACTCTTTTT-3′，UHMK1-shRNA#2：5′-CCGGCCCATTCTTTAGCATTC CTTTCTCGAGAAAGGAATGCTAAAGAATGGGTTTTT-3′。退火處理：99 ℃起，每分鐘下降1 ℃，直至4 ℃保存。用Solution Ⅰ連接酶將準(zhǔn)備好的插入片段連接到已酶切且含有嘌呤霉素和氨芐抗性的載體Plko.1，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞。24 h后，觀察群落生長(zhǎng)情況并挑取菌落，測(cè)序鑒定。

1.4 慢病毒包裝和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建將7.1 μg psPAX2、4.0 μg pMD2G、11.3 μg待包裝質(zhì)粒，混勻后加入330 μL的0.1×TE緩沖液，56.5 μL的2.5 mol/L氯化鈣溶液，加水至570 μL并混勻；緩慢加入570 μL的2×HBS緩沖液，邊加邊震動(dòng)；室溫孵育15 min，緩慢加入到70%豐度的293T細(xì)胞中，輕輕搖勻。接著將使用上述方法收集并使用0.45 μm濾膜過濾的慢病毒加入MDA-MB-231細(xì)胞，48 h后加入嘌呤霉素維持培養(yǎng)，進(jìn)而篩選含有嘌呤霉素抗性的細(xì)胞，從而構(gòu)建UHMK1穩(wěn)定敲低的細(xì)胞系。收集上述構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系并在RNA和蛋白水平分別對(duì)敲低效率進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)成功后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RNA提取和qRT-PCR法使用Trizol試劑從上述構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中提取總RNA。按照42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min的程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。GAPDH為內(nèi)參，每組設(shè)定3個(gè)平行孔。qRT-PCR引物序列如下：GAPDH上游5′-AGCAAGAGCACAA GAGGAAG-3′，下游5′-GGTTGAGCACAGGGTACTT T-3′；UHMK1上游5′-AGAGAAACCATGGGCAGAA G-3′，下游5′-CAAGCCATGAAACAGCATCT-3′；引物均由上海生工生物公司合成。

1.6 蛋白提取和Western blot法收集上述構(gòu)建成功的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，使用蛋白裂解液裂解并提取總蛋白，以actin為內(nèi)參進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，在300 mA條件下轉(zhuǎn)膜后置于5%脫脂牛奶中室溫?fù)u床封閉1 h；接著一抗4 ℃孵育過夜，使用PBST洗膜3次后加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜3次，漂洗后使用ECL避光顯影。

1.7 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞活力使用PBS洗滌并用胰酶消化待檢測(cè)的細(xì)胞，使用培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×104/mL，在96孔板中每孔接種100 μL，每組重復(fù)6個(gè)孔，設(shè)置5個(gè)相同的96孔板。于24 h后檢測(cè)細(xì)胞活力，棄培養(yǎng)液后每孔加入100 μL MTT液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，將MTT液更換為等體積的DMSO并避光輕搖15 min。最后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處吸光度值。

1.8 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力使用PBS洗滌并用胰酶消化待檢測(cè)的細(xì)胞，使用培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×103/mL，在6孔板中每孔接種2 mL，每組重復(fù)3個(gè)孔。于14天后使用甲醛固定，結(jié)晶紫染色，并拍照留存。

1.9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力在Transwell小室的下室中加入600 μL含有10%FBS的培養(yǎng)基，常規(guī)消化處理細(xì)胞并使用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/mL。每組各取200 mL分別加入無或有Matrigel包被的上室中，分別培養(yǎng)8、16 h。培養(yǎng)結(jié)束后，置于甲醛中固定30 min，使用結(jié)晶紫染色，PBS清洗后拍照留存。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)感染UHMK1-shRNA的效率采用qRT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中UHMK1-shRNA的干擾效率，結(jié)果顯示，與感染Plko.1的對(duì)照組相比，UHMK1-shRNA#1和UHMK1-shRNA#2組UHMK1的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

圖1 A.qRT-PCR檢測(cè)在MDA-MB-231中UHMK1-shRNA對(duì)UHMK1 mRNA的干擾效率；B.Western blot法檢測(cè)在MDA-MB-231中UHMK1-shRNA對(duì)UHMK1蛋白的干擾效率

2.2 沉默UHMK1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響使用上述構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，應(yīng)用MTT法檢測(cè)感染UHMK1-shRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與感染Plko.1的對(duì)照組相比，感染UHMK1-shRNA#1和UHMK1-shRNA#2后，細(xì)胞活力顯著下降(P<0.01，圖2)。

圖2 MTT檢測(cè)干擾UHMK1表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

2.3 沉默UHMK1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力的影響應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染UHMK1-shRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力的影響?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與感染Plko.1的對(duì)照組相比，感染UHMK1-shRNA#1和UHMK1-shRNA#2后，細(xì)胞克隆形成能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

圖3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾UHMK1的表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 沉默UHMK1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染UHMK1-shRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與感染Plko.1的對(duì)照組相比，感染UHMK1-shRNA#1和UHMK1-shRNA#2后，細(xì)胞遷移及侵襲能力均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，也是繼肺癌后女性惡性腫瘤相關(guān)死亡的第二大原因[8]。目前乳腺癌的治療方式是以手術(shù)治療為主，放、化療和分子靶向治療為輔，盡管各種治療方法有了一定進(jìn)展，但治療效果依然無突破性改變[9-11]。近年，關(guān)于乳腺癌治療的相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)研究較多。張明珍等[12]采用免疫組化法檢測(cè)42例乳腺癌及其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中STRING蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)STRING蛋白在乳腺癌中低表達(dá)，且STRING蛋白低表達(dá)是乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素之一。居紅格等[13]通過對(duì)76例乳腺癌及其配對(duì)的癌旁正常乳腺組織進(jìn)行免疫熒光染色分析發(fā)現(xiàn)，RHBDD1在乳腺癌中高表達(dá)，且RHBDD1與EGFR的表達(dá)呈正相關(guān)，推測(cè)RHBDD1可能通過參與EGFR通路的激活，誘導(dǎo)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。盡管如此，乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制仍不明確。因此，尋找與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因及其分子機(jī)制，目前已成為該領(lǐng)域迫切需要解決的科學(xué)問題。

UHMK1是一種廣泛表達(dá)的核絲氨酸/蘇氨酸激酶[14]。Katchman等[15]利用一種可編程的ELISA平臺(tái)對(duì)153例血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中包括63例卵巢癌樣本、30例良性卵巢對(duì)照樣本以及60例健康對(duì)照樣本；檢測(cè)發(fā)現(xiàn)UHMK1在卵巢癌患者的血清樣本中表達(dá)上調(diào)。Wei等[16]通過轉(zhuǎn)錄組分析以及實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UHMK1是YAP的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，可調(diào)控特定細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)，如CCNB1和CCNB2，并影響肝癌細(xì)胞的增殖以及DNA修復(fù)。此外，F(xiàn)eng等[17]通過分析癌癥基因組圖譜(TCGA)中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)UHMK1的DNA在胃癌中經(jīng)常出現(xiàn)擴(kuò)增。通過分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)UHMK1在胃癌中顯著上調(diào)，進(jìn)一步通過體、內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可通過促進(jìn)嘌呤合成途徑誘導(dǎo)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。但是，關(guān)于UHMK1在乳腺癌中的具體功能尚未見相關(guān)報(bào)道。為探索UHMK1在乳腺癌進(jìn)展中的作用，本實(shí)驗(yàn)選取了乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，采用shRNA干擾其UHMK1表達(dá)，并進(jìn)一步使用嘌呤霉素篩選構(gòu)建成穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，進(jìn)行一系列的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：干擾UHMK1表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力、克隆形成能力、遷移及侵襲能力均顯著下降，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，沉默UHMK1表達(dá)可抑制乳腺癌的增殖、遷移及侵襲能力。由此推測(cè)，UHMK1可能參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，但其具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步分析，可在一定程度上為乳腺癌的診斷和治療提供新思路。