宋芳婷，李 冉，李閏婷，聶曉寧，侯 雯，張麗萌

(鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450044)

0 引言

組織金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是金屬蛋白酶的內(nèi)源性抑制劑，在各種細(xì)胞中均有表達(dá)，主要作用于調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶活性和抑制細(xì)胞外基質(zhì)的轉(zhuǎn)化，包括參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、侵襲及細(xì)胞凋亡等過(guò)程[1]。迄今為止哺乳動(dòng)物TIMPs家族共有4個(gè)成員，包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4，在結(jié)構(gòu)上均具有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中TIMP1最初是以膠原酶抑制劑的形式在體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞、人血清以及牛軟骨和兔骨中分離發(fā)現(xiàn)的，可抑制所有膠原酶的活性，是TIMPs家族中的一個(gè)重要基因[2-3]。

有研究顯示，TIMP1基因能夠作用于小鼠子宮和卵巢組織，從而參與調(diào)控小鼠的生殖周期，另外還可作為一種類(lèi)固醇生成的調(diào)節(jié)劑。在山羊的研究中發(fā)現(xiàn)TIMP1基因可以增加輸卵管上皮細(xì)胞的增殖，表明TIMP1基因在促進(jìn)輸卵管上皮細(xì)胞的存活中可發(fā)揮重要作用[4]。有研究表明，TIMP1主要在卵泡中表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、凋亡和激素合成。因此，初步推測(cè)在綿羊生產(chǎn)中TIMP1基因可能會(huì)對(duì)其繁殖性狀存在一定的影響，并且目前TIMP1基因調(diào)控卵泡發(fā)育的分子機(jī)制尚不明確。鑒于此，本研究以綿羊卵巢為研究對(duì)象，通過(guò)分析TIMP1基因不同發(fā)育時(shí)期卵巢中的表達(dá)差異及構(gòu)建表達(dá)載體，為進(jìn)一步深入研究其生物學(xué)功能及在卵泡發(fā)育中的作用機(jī)制奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和菌株

綿羊卵巢組織、pEGFP-C1載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、HEK293F細(xì)胞株由鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

Trizol、Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；限制性?xún)?nèi)切酶NheⅠ和EcoRⅠ，購(gòu)自NEB公司；Pfu酶、質(zhì)粒小提試劑盒、DMEM、0.25%胰酶、ReverAid First Strand cDNA synthesis kit，均購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的His單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹；Green Taq Mix聚合酶、同源重組試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司；Opti-MEM、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自BI公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中綿羊TIMP1基因的編碼序列，設(shè)計(jì)特異性引物TIMP1-PF 5′-AGAATTCGAAGCTTGAGCTATGGCCCTCTTTGCACC-3′；TIMP1-PR 5′- CCTAGGTGGCCTAGATCTCGCCCCCCGGGGCCG-3′，由上海生工合成。

1.4 卵巢組織RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

利用TRIzol法提取不同發(fā)育時(shí)期(產(chǎn)多胎和產(chǎn)單胎)的綿羊卵巢組織的RNA，并進(jìn)行純度的測(cè)定，參考TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5 熒光定量PCR

為明確TIMP1在不同卵巢組織中的差異表達(dá)，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(10 μL)如下：cDNA 1 μL、上游和下游引物各1 μL、SYBR Green PCR mix 5 μL、Rnase-Free H2O 3.6 μL。 PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 15 s，共45個(gè)循環(huán)；60℃～95℃，每循環(huán)增加0.5制作熔解曲線。每個(gè)反應(yīng)體系設(shè)3個(gè)重復(fù)，由PCR擴(kuò)增曲線得到Ct值。

1.6 重組載體pEGFP-C1-TIMP1的構(gòu)建

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，利用Pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增TIMP1基因，克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞并送測(cè)序。將EcoRI/BamHI雙酶切后的產(chǎn)物連接至pEGFP-C1線性化載體，37℃連接30 min，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB平板后挑取單菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

提取真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-TIMP1，轉(zhuǎn)染至生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293F細(xì)胞，同時(shí)以空載體質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取及差異分析

利用Trizol法提取的RNA測(cè)得OD260/280 nm值為1.8～2.0，說(shuō)明提取總RNA質(zhì)量較好，可用于RT-PCR擴(kuò)增。采用RT-PCR技術(shù)對(duì)綿羊不同卵巢組織TIMP1基因的表達(dá)量進(jìn)行了定量分析。按照2-△△Ct法計(jì)算出TIMP1基因在綿羊不同卵巢組織的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，TIMP1基因在不同卵巢組織中均能被檢測(cè)到，在產(chǎn)多胎中的綿羊卵巢組中表達(dá)量最高。

2.2 TIMP1基因的克隆

以提取的綿羊卵巢組織反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，通過(guò)RT-PCR成功擴(kuò)增獲得綿羊TIMP1基因，大小約669 bp(見(jiàn)圖1)，與預(yù)期結(jié)果大小一致。

M—Trans2K? Plus DNA Marker；1—TIMP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 PCR菌落鑒定

挑選平板上的克隆進(jìn)行PCR菌落鑒定，擴(kuò)增大小為669 bp，選擇鑒定正確的克隆送測(cè)序，經(jīng)測(cè)序分析后確定與GenBank中預(yù)測(cè)的基因序列同源性為100%。

2.4 TIMP1蛋白表達(dá)檢測(cè)

將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-TIMP1利用Lipofectamine2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HEK293F細(xì)胞，過(guò)表達(dá)48 h后在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞有綠色熒光，表明pEGFP-C1-TIMP1真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，并且能在HEK 293細(xì)胞中正常表達(dá)。

3 討論

隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化生產(chǎn)，產(chǎn)羔性狀成為重要的繁殖性狀，與養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益息息相關(guān)，因此提高產(chǎn)羔數(shù)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。卵巢組織在生殖過(guò)程中起著重要作用，影響發(fā)情、卵泡發(fā)育和排卵等[5]。本研究中，以綿羊卵巢組織為材料，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)在不同組卵巢組中TIMP1基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，TIMP1基因在多胎綿羊卵巢組織的表達(dá)量顯著高于單胎組，這表明TIMP1基因的表達(dá)有可能影響綿羊的卵巢功能。目前TIMP1基因在調(diào)控卵泡發(fā)育的分子機(jī)制尚不明確，因此該基因?qū)d羊卵泡發(fā)育的調(diào)控作用機(jī)制還有待深入研究。

在研究中最常用的基因功能研究方法包括過(guò)表達(dá)和干擾RNA技術(shù)，其中過(guò)表達(dá)主要通過(guò)克隆構(gòu)建來(lái)實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的超表達(dá)[6]，本研究中選擇pEGFP-C1載體進(jìn)行過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中后可能表達(dá)綠色熒光蛋白，在顯微鏡下通過(guò)觀察綠色熒光來(lái)判斷TIMP1蛋白的表達(dá)情況。劉同君[7]等通過(guò)構(gòu)建GRP78基因超表達(dá)載體從而闡明了該基因在免疫調(diào)控方面的新功能。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-TIMP1并在HEK293F細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)構(gòu)建綿羊TIMP1基因的真核表達(dá)載體可為后期研究該基因的重要功能等方面提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步探究其對(duì)綿羊產(chǎn)羔性狀的調(diào)控機(jī)理提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。