郭 晨 李 夕 郭珮怡 楊建剛 楊海燕 曹愛(ài)蘭 張 俏

1.陜西醫(yī)藥控股醫(yī)藥研究院有限公司藥物質(zhì)量研究部，陜西西安 710000；2.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710000；3.陜西中藥研究所 陜西醫(yī)藥信息中心，陜西咸陽(yáng) 712000

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效[1-2]。金銀花作為傳統(tǒng)中藥材，含有黃酮類、有機(jī)酸類、環(huán)烯醚萜苷類、三萜皂苷類、揮發(fā)油類、無(wú)機(jī)元素類、有機(jī)元素類等[3-5]多種化學(xué)成分，在解熱、抗炎[6-9]、抗菌[10-13]、抗病毒[14-15]等方面均發(fā)揮較顯著療效，同時(shí)在抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、降低血糖、保肝、保護(hù)肺臟、保護(hù)神經(jīng)、治療婦科疾病等方面亦表現(xiàn)出一定的作用[16]。由于該藥化學(xué)成分種類較多、極性強(qiáng)、含量差異大，采用傳統(tǒng)方法研究金銀花中的有效成分難度較大、耗時(shí)較長(zhǎng)，因此，找到快速、高效地方法對(duì)金銀花中的化學(xué)成分進(jìn)行分析、檢測(cè)、辨別，對(duì)提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義[17]。

金銀花配方顆粒是以金銀花藥材為原料，經(jīng)過(guò)提取、濃縮、干燥、制粒等工藝制備而成，失去了金銀花藥材的外觀特征，難以直接鑒別，且很難用某一成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)來(lái)全面衡量配方顆粒的品質(zhì)，需要制訂專屬性、重復(fù)性更強(qiáng)且更加有效的方法來(lái)控制金銀花藥材配方顆粒的質(zhì)量。特征圖譜的研究能很好地為金銀花配方顆粒在化學(xué)成分層面上的定性鑒別提供依據(jù)。為保證金銀花配方顆粒安全、有效、質(zhì)量可控，本研究采用HPLC法建立金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒的特征圖譜，并比較四者主要化學(xué)成分的差異。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Thermo Scientific U3000紫外檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器）；電子分析天平（Ag135、Ag285、PB3002-S，梅特勒）；超聲波清洗器（KQ5200型，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，S41A1，HoneyWell）；甲醇（分析純，2018072501，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；磷酸（分析純，2014102401，成都市科龍化工試劑廠）；水為超純水。

綠原酸對(duì)照品（CAS號(hào)：327-97-9，批號(hào)：110753-201817，純度：96.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；新綠原酸對(duì)照品（CAS號(hào)：906-33-2，批號(hào)：1025257186，純度：≥98.0%，SIGMA）；隱綠原酸對(duì)照品（CAS號(hào)：905-99-7，批號(hào)：P30A9L69104，純度：≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司）；異綠原酸A（3，5-O-二咖啡酰奎寧酸）對(duì)照品（CAS號(hào)：2450-53-5，批號(hào)：Y24N8Y49 009，純度：≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司）；異綠原酸B（3，4-O-二咖啡?？鼘幩幔?duì)照品（CAS號(hào)：14534-61-3，批號(hào)：P20J9F53191，純度：≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司）；異綠原酸C（4，5-O-二咖啡?？鼘幩幔?duì)照品（CAS號(hào)：32451-88-0，批號(hào)：P25J9L 66496，純度：≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司）。

15批金銀花藥材（編號(hào)、產(chǎn)地依次為：S1-河南、S2-山東、S3-山東、S4-山東、S5-山東、S6-山東、S7-陜西柞水下梁鎮(zhèn)、S8-陜西山陽(yáng)縣戶坦鎮(zhèn)、S9-陜西鎮(zhèn)安縣采糧鎮(zhèn)、S10-山東、S11-山東、S12-山東、S13-湖北、S14-湖北、S15-湖北）；15批金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑（編號(hào)依次為：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15，來(lái)源：自制）；15批金銀花中間體（編號(hào)依次為：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15，來(lái)源：自制）；15批金銀花配方顆粒（編號(hào)依次為：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15，來(lái)源：自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific AcclaimTM120 C18（5 μm，4.6×250 mm）；流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相A，0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2000[1]。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品及供試品溶液的制備

2.2.1 參照物溶液的制備 取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為40 μg/mL的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度分別為40 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.2.3 金銀花藥材供試品溶液的制備 取金銀花藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備 取金銀花藥材100.0 g，加水量一般以浸過(guò)藥材平面2～5 cm為宜，浸泡30 min，提取兩次，每次15 min，過(guò)濾，合并兩次的提取液，減壓濃縮，即得標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品。

2.2.5 金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備 取標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品適量，制備方法同“2.2.3”項(xiàng)下。

2.2.6 金銀花中間體的制備 取金銀花藥材2000.0 g，加12倍量水，浸泡30 min，提取兩次，每次30 min，過(guò)濾，合并兩次的提取液，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.05～1.15（60℃），噴霧干燥，即得中間體供試品。

將實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度、實(shí)驗(yàn)室安排、儀器設(shè)備、場(chǎng)地布局和實(shí)驗(yàn)室最新?tīng)顩r等信息圖文并茂地發(fā)布在微信公眾平臺(tái)上，學(xué)生只要關(guān)注這個(gè)微信平臺(tái)，就能直接查閱詳細(xì)信息，了解到實(shí)驗(yàn)室最新最全的情況和動(dòng)態(tài)[12]。

2.2.7 金銀花中間體供試品溶液的制備 取中間體供試品適量，制備方法同“2.2.3”項(xiàng)下。

2.2.8 金銀花配方顆粒的制備 取金銀花藥材2000.0 g，加12倍量水，浸泡30 min，提取兩次，每次30 min，過(guò)濾，合并兩次的提取液，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.05～1.15（60℃），噴霧干燥，加入糊精制粒，即得配方顆粒供試品。

2.2.9 金銀花配方顆粒供試品溶液的制備 取配方顆粒供試品適量，制備方法同“2.2.3”項(xiàng)下。

2.3 方法學(xué)考察

借鑒2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部[1]中金銀花提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)流動(dòng)相的比較、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇、檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)的確定、提取溶劑的選擇等條件選擇實(shí)驗(yàn)，最終確定選取金銀花中6個(gè)綠原酸類成分為目標(biāo)成分。通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立了以綠原酸為參照物，同時(shí)評(píng)定金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒中新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C[18-23]的特征圖譜分析方法。

2.3.1 精密度試驗(yàn) 按照“2.2”項(xiàng)下方法制備金銀花4個(gè)品種供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，結(jié)果6個(gè)共有峰保留時(shí)間RSD小于0.06%、0.07%、0.07%、0.07%，峰面積RSD小于0.28%、0.16%、0.12%、0.15%，說(shuō)明該方法精密度良好，符合特征圖譜的要求。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“2.2”項(xiàng)下方法制備金銀花4個(gè)品種供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，每次10 μL[5]，結(jié)果6個(gè)共有峰保留時(shí)間RSD小于0.18%、0.19%、0.17%、0.17%，峰面積RSD小于0.60%、0.28%、0.22%、1.50%，說(shuō)明24 h穩(wěn)定性良好，符合特征圖譜的要求。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.2”項(xiàng)下方法分別制備金銀花4個(gè)品種供試品溶液各6份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，每次10 μL，結(jié)果6個(gè)共有峰保留時(shí)間RSD小于0.04%、0.04%、0.09%、0.04%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好，符合特征圖譜的要求。

2.3.4 耐用性試驗(yàn) 按照“2.2”項(xiàng)下方法制備金銀花4個(gè)品種供試品溶液，分別調(diào)整流速（0.8、1.2 mL/min），調(diào)整柱溫（25、35℃），調(diào)整流動(dòng)相中乙腈、水相的比例（乙腈比例增加2.5%、水相比例增加2.5%）分別進(jìn)樣檢測(cè)，并與“2.1”項(xiàng)下原色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。供試品色譜中均呈現(xiàn)6個(gè)特征峰，與綠原酸參照?qǐng)D譜進(jìn)行比對(duì)，與綠原酸峰保留時(shí)間一致的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間[24]，除水相比例增加2.5%和調(diào)整流速為0.8 mL/min條件下的相對(duì)保留時(shí)間在規(guī)定值的±8%之內(nèi)，其余均在規(guī)定值的±5%之內(nèi)，規(guī)定值為：0.76（峰1）、1.00（峰2）、1.05（峰3）、1.80（峰4）、1.87（峰5）、2.01（峰6）[1]，所以該方法耐用性基本良好。

2.4 特征圖譜的建立

2.4.1 金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒特征峰的確定 按照“2.2”項(xiàng)下方法分別制得混合對(duì)照品溶液和金銀花4個(gè)品種供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。通過(guò)比對(duì)各色譜峰保留時(shí)間和紫外吸收?qǐng)D譜，指認(rèn)其中6個(gè)色譜峰[25]，分別為：峰1-新綠原酸，峰2-綠原酸，峰3-隱綠原酸，峰4-異綠原酸B，峰5-異綠原酸A，峰6-異綠原酸C，見(jiàn)圖1。選擇6個(gè)共有峰中保留時(shí)間適中，且為檢測(cè)指標(biāo)成分的綠原酸峰作為S峰。

2.4.2 金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒特征圖譜的建立按照“2.2”項(xiàng)下方法分別制備 15批金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè)，將色譜圖導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，采用中位數(shù)法，對(duì)色譜圖進(jìn)行匹配，分別得到特征圖譜。

圖1 混合對(duì)照品圖譜

金銀花藥材中確定了6個(gè)共有峰，且15批金銀花藥材相似度均達(dá)到0.90以上，說(shuō)明金銀花藥材各產(chǎn)地間化學(xué)成分組成基本一致。見(jiàn)圖2。

圖2 15批金銀花藥材HPLC特征圖譜

金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑匹配出8個(gè)共有峰，但7、16 min左右的兩個(gè)小峰一部分批次不易識(shí)別，所以并未作為特征峰。15批金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度均達(dá)到0.90以上，說(shuō)明金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量均一、工藝穩(wěn)定。見(jiàn)圖3。

圖3 15批金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC特征圖譜

金銀花中間體匹配出8個(gè)共有峰，但7、16 min左右的兩個(gè)小峰一部分批次不易識(shí)別，所以并未作為特征峰。15批金銀花中間體相似度均達(dá)到0.90以上，說(shuō)明金銀花中間體質(zhì)量均一、工藝穩(wěn)定。見(jiàn)圖4。

金銀花配方顆粒確定了6個(gè)共有峰，且15批金銀花配方顆粒相似度均達(dá)到0.90以上，說(shuō)明金銀花配方顆粒質(zhì)量均一、工藝穩(wěn)定。見(jiàn)圖5。

圖4 15批金銀花中間體HPLC特征圖譜

圖5 15批金銀花配方顆粒HPLC特征圖譜

本研究采用HPLC法建立了金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒的特征圖譜，方法學(xué)考察結(jié)果表明此方法準(zhǔn)確、可行、重復(fù)性良好，可用于金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒的質(zhì)量控制。

2.4.3 金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒相關(guān)性分析 將金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒對(duì)照?qǐng)D譜導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012版）”，采用中位數(shù)法，對(duì)其匹配并進(jìn)行相似度計(jì)算，匹配圖譜見(jiàn)圖6，相似度結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

本試驗(yàn)采用HPLC法建立了金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒的特征圖譜，方法學(xué)考察中：精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD均小于3%；耐用性，均符合系統(tǒng)適用性要求，除水相比例增加2.5%和調(diào)整流速為0.8 mL/min條件下的相對(duì)保留時(shí)間在規(guī)定值的±8%之內(nèi)，其余均在規(guī)定值的±5%之內(nèi)，規(guī)定值為：0.76（峰1）、1.00（峰2）、1.05（峰3）、1.80（峰4）、1.87（峰5）、2.01（峰6）[1]，通過(guò)方法學(xué)考察試驗(yàn)結(jié)果可知，該方法適合用于金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒的特征圖譜檢測(cè)。

圖6 金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒對(duì)照?qǐng)D譜匹配圖

表2 金銀花藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒對(duì)照?qǐng)D譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

本研究中，金銀花藥材與標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體及配方顆粒的對(duì)照?qǐng)D譜的主要峰基本一致，主要化學(xué)成分組成基本相同，但是相似度未全達(dá)到0.9，僅接近0.8，說(shuō)明金銀花藥材在提取后，其成分上有一定變化，并且可以看出酚酸類成分的兩組同分異構(gòu)體在比例上也有明顯的改變，如異綠原酸A（3，5-O-雙咖啡?？鼘幩幔┑谋壤谔崛『竺黠@降低，而新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B（3，4-O-雙咖啡酰奎寧酸）、異綠原酸C（4，5-O-雙咖啡酰奎寧酸）的比例明顯升高；金銀花配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度達(dá)到了0.97以上，說(shuō)明配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分組成基本一致，兩者具有相同的藥用物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，以金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑為基準(zhǔn)，標(biāo)化金銀花配方顆粒的質(zhì)量有助于實(shí)現(xiàn)臨床用藥的一致性和安全性。