劉 君 董秋梅

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110

蒙古族藥文冠木（Xanthoceras sorbifolia Bunge），為無(wú)患子科植物文冠果的莖干，蒙語(yǔ)名霞日-森登，有祛風(fēng)止痛，散濕化瘀之功效，可治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、痛風(fēng)等[1-2]。前期研究顯示[3]，蒙藥森登-4可抑制RA模型大鼠滑膜新生血管增生，對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠骨破壞及CIA-FLS體外增殖有明顯抑制作用[4]。文冠木是其有效組成之一，含有豐富的黃酮類化合物。黃酮類化合物由5000多種結(jié)構(gòu)不同的天然化學(xué)物質(zhì)組成[5]，可預(yù)防多種疾病，如抗癌、抑菌[6-7]、預(yù)防人類骨質(zhì)流失[8]、抗病毒[9]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[10]，且對(duì)糖尿病、風(fēng)濕等免疫性疾病有療效[11-12]，另文冠果對(duì)阿爾茨海默病有抑制作用，可改善記憶障礙[13-14]。近年對(duì)于文冠木藥材的分離和提取[15-17]，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有報(bào)道[18-20]，但對(duì)文冠木主要黃酮類成分槲皮素和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）的質(zhì)量控制未見(jiàn)研究。文冠木內(nèi)含量較高的活性成分有二氫楊梅素、槲皮素、楊梅素、EGCG等[21]，本研究旨在建立槲皮素和EGCG含量測(cè)定方法，為其質(zhì)量控制提供參考，以期為研究單藥的有效成分及藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：20191125，純度：＞99%）、EGCG對(duì)照品（批號(hào)：20191126，純度：＞99.89%）均購(gòu)自成都德思特公司；文冠木藥材購(gòu)自內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)院，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中藥教研室任長(zhǎng)勝教授鑒定為文冠木。色譜級(jí)甲醇和乙腈，水為超純水。

液相色譜儀（美國(guó)Waters2695型）；BenchTop Pro真空冷凍干燥機(jī)（美國(guó)）；大孔樹(shù)脂（安徽三星樹(shù)脂科技有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；梅特勒-托利多分析天平（精密度：0.0005～0.0100 mg）

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液 5 kg文冠木經(jīng)蒸餾水浸泡1 h，水煎提取1 h，趁熱過(guò)濾藥液。60℃恒溫減壓濃縮。將濃縮后的文冠木提取物置于真空冷凍干燥機(jī)低溫升華干燥8 h后，密封置于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。用AB-8大孔樹(shù)脂分離提純，用水-95%乙醇體系不斷洗脫得到目標(biāo)段化合物后，再逐步減壓濃縮約200 mg。稱取文冠木提取物0.2 g，加入甲醇50 mL；以150 W、50 kHz超聲30 min，冷卻，稱重，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后制成供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液 稱取槲皮素對(duì)照品4.82 mg，EGCG對(duì)照品4.91 mg，用甲醇溶解并定容，得到槲皮素0.241 mg/mL、EGCG 0.246 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～45 min，95%A；45～46 min，40%A；46～50 min，95%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；流速：1 mL/min；柱溫：28℃；進(jìn)樣量：20 μL。

取文冠木供試品、槲皮素和EGCG對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，各待測(cè)成分的色譜峰與相鄰峰間分離度大于1.5，理論板數(shù)均在3000以上。見(jiàn)圖1。

2.3 檢測(cè)限與定量限

取槲皮素、EGCG對(duì)照品各適量，精密稱定后分別置于量瓶中，用流動(dòng)相溶解并逐級(jí)稀釋至一定溶度，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以信噪比（S/N=3±1）的濃度為檢測(cè)限，信噪比（S/N=10±1）的濃度為定量限。見(jiàn)表1。

2.4 線性范圍考察

分別量取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋至槲皮素對(duì)照品濃度為0.060、0.121、0.241、0.482、0.964 mg/mL；EGCG對(duì)照品濃度為0.062、0.123、0.246，0.492、0.984 mg/mL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求槲皮素、EGCG對(duì)照品的回歸方程。見(jiàn)表1。

圖1 對(duì)照品及供試品色譜圖

表1 槲皮素和EGCG線性范圍考察及檢測(cè)限、定量限

2.5 精密度

取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算槲皮素和EGCE峰面積的RSD值。結(jié)果槲皮素和EGCG峰面積的平均RSD分別為1.04%、1.06%。

2.6 重復(fù)性

取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液6份，進(jìn)樣測(cè)定槲皮素、EGCG峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，槲皮素、EGCG峰面積的平均RSD值均小于1.83%，表明該分析方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 穩(wěn)定性

取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定槲皮素、EGCG峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)槲皮素、EGCG峰面積平均RSD值均小于1.83%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率

稱取文冠木提取物0.2 g，共6份，分別加入槲皮素和EGCG對(duì)照品適量，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，在相同色譜條件下，反復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算回收率。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率

2.9 槲皮素和EGCG含量

3個(gè)批次文冠木提取物按“2.2.1”項(xiàng)下條件制備，按“2.2”條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算槲皮素、EGCG含量。見(jiàn)表3。

表3 槲皮素和EGCG含量

3 討論

文冠木是蒙古族習(xí)用藥材，廣泛運(yùn)用于臨床中，體現(xiàn)在消炎鎮(zhèn)痛、提高免疫力、增強(qiáng)記憶力、活血等方面，但對(duì)質(zhì)量控制研究的方法相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取文冠木黃酮類有效成分，經(jīng)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，確立水-乙醇梯度洗脫，建立完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[22]，最終確定流動(dòng)相：乙腈－水，才得到槲皮素和EGCG較好的峰形。HPLC法測(cè)定結(jié)果顯示文冠木提取工藝穩(wěn)定可靠，質(zhì)量控制簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)。

現(xiàn)代藥理表明，槲皮素可能通過(guò)下調(diào)Bcl2及上調(diào)Bax因子的表達(dá)，降低Bcl2/Bax比值，誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[23]，抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。槲皮素可通過(guò)抑制核因子-κB激活，減少炎性環(huán)境中軟骨細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-13的產(chǎn)生、加快基質(zhì)降解，促炎細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)軟骨的作用[23]；EGCG有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)心腦血管、抑菌、干預(yù)代謝酶等作用[24]，能顯著提高RA患者體內(nèi)CD19、白細(xì)胞介素-10、Breg在淋巴細(xì)胞內(nèi)占比，且與記憶B細(xì)胞和漿母細(xì)胞總和的比值升高有關(guān)[25]。由此，二者均對(duì)RA有一定的療效。

文冠木中槲皮素和EGCG含量可觀，為文冠木的臨床研究明確了方向。隨著文冠木化學(xué)成分及藥理活性的不斷被發(fā)掘被證實(shí)，文冠木作為一種具有發(fā)展前景的蒙古族藥，還需不斷深入研究，規(guī)范用藥指導(dǎo)，使單藥在治療RA中將起到不可估量的作用。