陳潤銘 杜玉青 李友山 董學宇 安 琪 謝存香

北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院周圍血管科，北京 100700

糖尿病足潰瘍是由糖尿病微血管病變導致的局部潰瘍，具有高發(fā)和高致殘的特點。截止到2019年，我國糖尿病足潰瘍的年發(fā)病率已經(jīng)達到8.1%，同時，糖尿病足潰瘍是造成非外傷性低位截肢的最主要原因之一[1]。因此控制糖尿病足潰瘍惡化以減少截肢的發(fā)生是糖尿病足潰瘍的治療重點。

中醫(yī)藥在治療糖尿病足潰瘍上有著豐富的經(jīng)驗和卓越的效果。銀芪軟膏是由全國名老中醫(yī)，我國周圍血管科專家龐鶴教授在總結(jié)自己治療糖尿病足潰瘍多年的臨床經(jīng)驗的基礎(chǔ)上研制而成的外用制劑，在臨床上收效顯著。李友山等[2]實驗中證實了銀芪軟膏有明顯促進糖尿病足潰瘍愈合的作用?！吨嗅t(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃綱要（2016—2030年）》[3]中指出鼓勵基于經(jīng)典名方、名醫(yī)名方、醫(yī)療機構(gòu)制劑等的中藥新藥研發(fā)。銀芪軟膏屬于名醫(yī)名方，應該得到開發(fā)與應用，這不僅符合國家中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略地實施，也為糖尿病足潰瘍提供新藥。然而銀芪軟膏的有效成分以及作用機制在現(xiàn)階段尚存疑，這使其質(zhì)量評價以及進一步開發(fā)受到了限制。

銀芪軟膏由金銀花、黃芪、三七組成，具有清熱解毒、化瘀生肌的作用。然而其具體生效機制并不是每味中藥功效的簡單相加，而是諸味藥物協(xié)同作用于人體而成的結(jié)果。找到中藥作用于機體生命活動的規(guī)律是發(fā)現(xiàn)中藥作用機制的關(guān)鍵。網(wǎng)絡藥理學是一門把系統(tǒng)生物學和藥理學相結(jié)合的新學科，它能夠把中藥化學成分、化學成分的作用靶點、疾病靶標以及信號通路聯(lián)系起來，構(gòu)建“中藥-化學成分-靶標-通路”相互作用的網(wǎng)絡關(guān)系，通過對網(wǎng)絡的富集分析，從中發(fā)現(xiàn)藥物與疾病的關(guān)系。這為找到藥物的作用機制和開發(fā)新藥提供了新思路[4]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學構(gòu)建了銀芪軟膏與糖尿病足潰瘍的“中藥-化學成分-核心靶標-通路”的網(wǎng)絡，旨在探討銀芪軟膏對糖尿病足潰瘍的干預機制，為銀芪軟膏的質(zhì)量評價及新藥開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 銀芪軟膏與糖尿病足潰瘍“成分-靶標-通路-疾病”的網(wǎng)絡構(gòu)建

1.1.1 銀芪軟膏化學成分來源 在中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺2.0（TCMIP v2.0）選擇中藥材數(shù)據(jù)庫這一模塊，在頁面分別輸入“金銀花”“黃芪”“三七”，即可獲得這3味中藥的化學成分，建立銀芪軟膏的化學成分數(shù)據(jù)庫。

1.1.2 候選靶標來源及靶標預測 在TCMIP v2.0疾病相關(guān)分子數(shù)據(jù)庫，輸入“Diabetic Foot Ulcer”作為疾病關(guān)鍵詞進行檢索，就可以收集到糖尿病足潰瘍的候選疾病靶標。選擇中藥靶標預測及功能分析模塊，輸入“金銀花-黃芪-三七”，選取相似性分數(shù)≥0.8的成分預測靶標作為候選。TCMIP v2.0利用Tanimoto系數(shù)定義的相似度計量方法，針對中藥化學成分（可根據(jù)成藥性等級進行篩選）與食品藥品監(jiān)督管理局上市藥物進行相似性打分，取相似分數(shù)≥0.8的中藥候選靶標。

1.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）信息 銀芪軟膏的潛在靶標與糖尿病足潰瘍疾病靶標之間的PPI可通過TCMIP v2.0直接獲得，該平臺整合了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、DIP、PDZBase等多個蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫。

1.1.4 網(wǎng)絡構(gòu)建與分析 通過TCMIP v2.0的中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡挖掘模塊，針對銀芪軟膏作用的潛在靶標與糖尿病足潰瘍疾病靶標之間的PPI信息計算網(wǎng)絡特征值，以“節(jié)點連接度（degree）”的2倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶標-疾病基因互作網(wǎng)絡的核心節(jié)點（hubs）；在此基礎(chǔ)上，以“degree”“節(jié)點緊密度（closeness）”和“節(jié)點介度（betweenness）”的中位數(shù)為卡值，選取同時滿足3個卡值的節(jié)點為銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍的關(guān)鍵靶標網(wǎng)絡。通過基因功能和通路的富集分析，進一步挖掘銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍的關(guān)鍵靶標及其對應的活性成分，并構(gòu)建可視化的“中藥-化學成分-核心靶標-通路”多層次網(wǎng)絡關(guān)聯(lián)圖。

1.2 基因功能和通路富集分析

在TCMIP v2.0平臺選擇中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡挖掘模塊，依托Reactome數(shù)據(jù)庫的Pathway信息，篩選銀芪軟膏關(guān)鍵網(wǎng)絡靶標基因顯著參與的分子通路；依托基因本體數(shù)據(jù)庫（GO）篩選銀芪軟膏關(guān)鍵網(wǎng)絡靶標基因顯著參與的生物學反應、所行使的分子功能及其所在細胞內(nèi)定位；通過KEGG富集分析，針對銀芪軟膏的關(guān)鍵潛在靶標，進行基因功能分析和通路分析，并將P值排名靠前的通路展示在結(jié)果中。

2 結(jié)果

2.1 銀芪軟膏化學成分預測及靶標分析

金銀花總共收集化學成分47個，預測靶標163個，主要為有機酸類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類等。黃芪總共收集化學成分27個，預測靶標399個，主要由黃酮類、皂苷類、多糖類等組成。三七總共收集化學成分79個，預測靶標246個，其中主要成分為三七總皂苷。其中金銀花與黃芪共有靶標120個，金銀花與三七共有靶標136個，黃芪與三七共有靶標217個。

對銀芪軟膏進行基因分析（表1），可見候選靶標基因功能分析涉及類固醇激素介導的信號通路、離子跨膜運輸、脂質(zhì)代謝過程等條目。對銀芪軟膏候選靶標進行通路富集分析（表2），可見涉及核受體轉(zhuǎn)錄途徑、γ-氨基丁酸（GABA）受體激活、二氧化碳的可逆水合作用、白細胞介素-4和白細胞介素-13信號等通路。

2.2 銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍的核心靶標網(wǎng)絡

通過TCMIP v2.0的中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡挖掘模塊，構(gòu)建銀芪軟膏潛在靶標與疾病靶標相互作用網(wǎng)絡，見圖1。根據(jù)條件篩選出核心靶標網(wǎng)絡12個節(jié)點，節(jié)點大小與degree呈正相關(guān)，其中核心節(jié)點有4個，疾病與藥物聯(lián)系最密切的靶標為ABL1。

表1 銀芪軟膏候選靶標基因功能分析

2.3 銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍的GO基因功能及KEGG通路富集分析

圖1 銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍核心靶標網(wǎng)絡

銀芪軟膏的GO基因功能分析結(jié)果顯示有共因子代謝過程、一氧化氮合成活性調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)，DNA模板化、基因表達的負調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的正反調(diào)節(jié)、DNA模板化的9個條目。見表3。銀芪軟膏的kEGG通路富集分析結(jié)果顯示其主要作用通路包括四氫生物蝶呤（BH4）的合成、再循環(huán)、回收和調(diào)節(jié)，一氧化氮合成酶（eNOS）激活，血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）介導的血管通透性3個條目。見表4。

表3 銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍關(guān)鍵靶標基因功能分析

表4 銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍關(guān)鍵靶標通路富集分析

2.4 銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍的“中藥-成分-靶標-通路”多維網(wǎng)絡

銀芪軟膏的關(guān)鍵藥靶一共有4個，靶標大小與相關(guān)度呈正相關(guān)。見圖2。圖中最大的靶標為HSP90AA1。該網(wǎng)絡還與53個化學成分相關(guān)聯(lián)，其中黃芪4個，分別為β-谷甾醇、華良姜素、黃芪皂苷Ⅶ、4-二甲氧基異黃烷-7-O-β-D-葡萄糖苷。金銀花16個，分別是β-谷甾醇、豆甾醇、胡蘿卜苷、常春藤皂甙元、木樨草素、三萜皂苷類、忍冬甙、灰氈毛忍冬皂苷、常春藤皂苷H、新長春皂苷等。三七33個，含有β-谷甾醇、豆甾醇、胡蘿卜苷、人參皂苷、三七皂苷、西洋參皂苷等。

圖2 銀芪軟膏的“藥物-成分-靶標-通路”圖

3 討論

糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的處理一直是糖尿病足治療的難點和重點。在最新的指南里，中醫(yī)藥外治也是創(chuàng)面處理的重要手段之一[1]。銀芪軟膏是我國周圍血管科名老中醫(yī)龐鶴教授的經(jīng)驗方，非常適用于中醫(yī)藥法關(guān)于經(jīng)典名方的開發(fā)。銀芪軟膏由金銀花、黃芪、三七組成。金銀花為君藥，甘潤寒清，清熱解毒，為治熱毒所致的癰瘡疔癤的要藥。黃芪為佐藥，甘溫升補，又能托毒生肌，善治瘡瘍難潰難腐。三七散瘀止血，消腫定痛，能驅(qū)瘀毒。諸藥合用，既能清熱解毒，又能補虛托毒外出，驅(qū)逐瘀毒，起到去腐生肌之功。然而現(xiàn)階段中藥成分復雜，其作用機制難以闡明。

網(wǎng)絡藥理學融合了中藥學、化學、生物基因?qū)W、藥理學等多學科的大數(shù)據(jù)，利用計算機科學技術(shù)，形成多學科交叉，多層次融合的網(wǎng)絡，把原本孤立的中藥化學成分與疾病靶標等聯(lián)系起來，構(gòu)建了中藥多成分與活性之間的關(guān)聯(lián)，為明確中藥藥效物質(zhì)及其分子機制和進一步開發(fā)名醫(yī)名方提供了新的手段[5-6]。本研究正是從網(wǎng)絡藥理學角度出發(fā)，探討銀芪軟膏干預糖尿病足潰瘍的機制。

金銀花具有廣譜抗菌作用，對糖尿病足潰瘍感染的常見細菌如金黃色葡萄球菌等具有抑制作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，金銀花含有的綠原酸和異綠原酸具有明顯的抗菌作用[8]。除此之外，金銀花提取物還有改善胰島素抵抗的作用[9]。黃芪中黃芪總皂苷不僅能抑制細胞炎癥反應、保護內(nèi)皮細胞，而且能降低血糖[10]。黃芪的黃酮類可通過調(diào)節(jié)核因子NF-κB信號通路抑制炎癥反應[11-12]。三七總皂苷可調(diào)節(jié)趨化因子2（CCL2）誘導的細胞內(nèi)氧化應激來減輕細胞炎癥[13]。高愛社等[14]實驗證實三七總皂苷對損傷的內(nèi)皮細胞具有修復作用。3味中藥的作用靶點均有重合，這提示藥物的之間存在藥效疊加的可能。

銀芪軟膏與糖尿病足潰瘍共有靶標1個，為ABL1，ABL1屬于非受體酪氨酸激酶，參與各種細胞過程，包括細胞生長和分裂、成熟和移動。在不同的細胞狀況下，它既可以幫助細胞生存，也觸發(fā)受控細胞凋亡。因此目前對ABL1的研究多在ABL1突變后引起的慢性骨髓性白血病[15]。至于ABL1與糖尿病足潰瘍關(guān)系鮮有文獻記錄，有待研究的進一步深入挖掘。

銀芪軟膏的主要活性成分可針對多個靶點、多條通路起到促進糖尿病足潰瘍恢復的作用。其作用可能與BH4的合成、eNOS激活、VEGFR2介導的血管通透性有關(guān)。BH4是內(nèi)皮eNOS活性所必需的輔因子。eNOS產(chǎn)生的一氧化氮（NO）是血管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵介質(zhì)，也是維持正常內(nèi)皮功能的一個關(guān)鍵方面。eNOS的酶活性取決于其輔因子BH4的可用性。當BH4水平足夠時，eNOS產(chǎn)生NO；反之，當BH4水平受到限制時，eNOS會發(fā)生酶解偶聯(lián)并生成超氧化物，從而導致血管氧化應激和內(nèi)皮功能障礙[16]。在高糖狀態(tài)下，BH4的合成會下降進而導致血管內(nèi)皮受損。因此，BH4是修復糖尿病造成的內(nèi)皮受損的治療靶點[17]。故銀芪軟膏可能是通過促進BH4的合成，來激發(fā)eNOS，實現(xiàn)維持血管內(nèi)皮功能的正常，進一步促進糖尿病足潰瘍愈合。VEGFR2是已知的VEGF家族中血管生成和構(gòu)造的主要調(diào)節(jié)者，它能夠提高血管通透性，也是參與內(nèi)皮細胞的增殖、分化及血管的通透性的重要物質(zhì)[18-19]。血管通透性與血管生成有密切關(guān)系，它能調(diào)節(jié)內(nèi)皮屏障的開放，活化內(nèi)皮細胞的功能[20]。

銀芪軟膏最大的靶標為HSP90AA1，是相關(guān)性最強的靶標。而在Reactome信號通路數(shù)據(jù)庫中，HSP90AA1涉及的通路包含BH4的合成、再循環(huán)、回收和調(diào)節(jié)，eNOS激活，VEGFR2介導的血管通透性，恰與銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍的通路一致，相較之下其他的靶標均不夠其全面，可推測其正是關(guān)鍵靶標。但目前關(guān)于HSP90AA1的研究都局限在它參與腫瘤細胞的分化、增殖和血管生成[21-22]。至于它是否也參與內(nèi)皮細胞的血管再生有待深入研究。β-谷甾醇是3味中藥的共有的化學成分。有實驗表明β-谷甾醇通過促炎性細胞因子和趨化因子的釋放減少，抑制STAT1信號通路來抗炎[23-26]。除此之外，它還有降低血糖的作用[27]。

銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍效果顯著，此次對其分子機制及發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究可以為銀芪軟膏及其所含中藥成分的進一步研究提供依據(jù)。但本研究是基于整合藥理學平臺的預測，具體機制乃至新藥開發(fā)還需要具體的實驗研究支撐。希望能以本研究為基礎(chǔ)，在實驗研究中得到進一步驗證。