耿蓓，李寬，2，吳琦，李雙艷 ，陳懷永 ，2，4

支氣管哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，主要特征之一為氣道上皮黏膜的損傷和重塑。研究氣道上皮黏膜損傷后的修復對維持以哮喘為代表的氣道炎癥性疾病的肺穩(wěn)態(tài)具有非常重要的意義。氣道上皮黏膜由多種細胞群組成，豐度較高的細胞群為Club細胞（又稱Clara 細胞）。Clara 細胞分泌蛋白（Clara cell secretory protein，CCSP）是Club 細胞特異性表達的標志物［1］。包括Club細胞在內(nèi)的氣道上皮祖細胞的增殖功能是維持氣道上皮完整性和損傷后上皮黏膜修復的重要因素［2］，但其相關研究較少。近年來體外類器官模型逐漸成為研究干（祖）細胞功能的重要手段，本課題組前期通過建立氣道Club細胞3D類器官模型，觀察Club細胞在體外培養(yǎng)形成類器官的直徑和形成數(shù)量來判定其增殖功能［3］。筆者之前的研究表明，在雞卵清蛋白（OVA）誘導的小鼠哮喘模型中，葡萄糖代謝對氣道Club細胞的增殖功能起重要調(diào)控作用，阻斷糖酵解途徑可抑制Club細胞的增殖，不利于氣道上皮損傷后炎癥的消退［4］。磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）是機體除糖酵解途徑外的另一種葡萄糖代謝途徑。在OVA 誘導的小鼠哮喘中磷酸戊糖途徑是否也參與了對Club細胞增殖的調(diào)控，從而影響哮喘氣道炎性損傷的修復進程尚不清楚。本研究采用3D類器官培養(yǎng)模型，觀察磷酸戊糖途徑的關鍵酶葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（G6PD）抑制劑6?氨基煙酰胺（6?AN）對Club細胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性SPF 級C57BL/6 小鼠26 只，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學海河臨床學院實驗動物中心［許可證號：SYXK（津）2016?0002］。實驗動物飼養(yǎng)和管理過程均遵守天津醫(yī)科大學海河臨床學院實驗動物管理規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 小鼠肺成纖維細胞系（MLg）購自美國ATCC 細胞庫。哮喘造模采用自主研發(fā)制作的霧化倉（專利號：CN 208910567 U），熒光定量 PCR（qPCR）儀（Light Cycler 96，Roche），酶標儀（Multiskan Go，Thermo），倒置顯微鏡（Olympus 公司），F(xiàn)ACS Aria Ш 分選儀（BD Biosciences）。6?AN、OVA、氫氧化鋁佐劑和DNase I 均購自美國Sigma 公司。山羊源一抗抗體（CCSP）購自Santa Cruz Biotechnology 生物科技有限公司，兔源一抗抗體（Ki67）購自Cell signaling Technology 公司，驢源抗山羊二抗（Alexa Fluor?594 Donkey Anti?Goat IgG）和驢源抗兔二抗（Alexa Fluor?488 Donkey Anti?Rabbit IgG）均 購自 Invitrogen 公 司 。 流 式抗體 anti?CD24?phycoerythrin（PE）、anti?EpCAM?PE?Cyanine7、Sca?1?allophycocyanin（APC）、anti?CD31?biotin、anti?CD34?biotin、anti?CD45?biotin、APC?eFluor 780、7?amino?actinomycin D（7AAD）均購自 eBioscience 公司，Matrigel 基質(zhì)膠購自 BD Pharmingen 公司，24?well Transwell 小室購自 Corning 公司。TRIzol 購自 Invitrogen 公司，SYBR Green PCR 擴增試劑盒購自Roche公司。

1.3 小鼠哮喘模型的建立 將12只雌性小鼠按隨機數(shù)字表法均分成哮喘組和對照組。OVA 溶液由PBS 54.6 μL，氫氧化鋁44.4 μL，OVA儲液（10 g/L）1 μL配制而成。哮喘組在第0、7 天腹腔內(nèi)注射 OVA 溶液 100 μL 致敏。在第 14～18 天，用2%OVA溶液連續(xù)激發(fā)霧化5 d，0.5 h/次，1次/d。對照組用PBS 替代OVA 溶液，其他條件均相同。在第19 天時用7.5%水合氯醛麻醉小鼠，取肺組織。

1.4 三色染色法統(tǒng)計支氣管灌洗液（BALF）中的細胞類型和數(shù)量 收集上述哮喘造模后的BALF，1 000 r/min離心15 min后量取上清液的體積，細胞沉淀加PBS混勻，取10 μL加臺盼藍溶液按比例（1∶5）稀釋后用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。剩余細胞懸液涂片晾干后用Hema 3 染色劑進行染色，染色順序如下：固定液（固定），染液Ⅰ（染核），染液Ⅱ（染質(zhì)）。乙醇脫色后在顯微鏡下觀察細胞個數(shù)、形態(tài)、胞核胞質(zhì)的顏色，統(tǒng)計各種類型細胞數(shù)。

1.5 免疫熒光染色法檢測氣道Club細胞增殖 用10%福爾馬林溶液固定哮喘造模后獲取的肺組織，2 h后脫水、石蠟包埋和切片（5 μm）。切片脫蠟后在煮沸的檸檬酸抗原修復液中修復2 min，自然冷卻至室溫后加一抗（Ki67和CCSP，抗體和5%BSA溶液按1∶200稀釋）于4 ℃孵育過夜；PBS泡洗后加二抗（驢源抗山羊二抗和驢源抗兔二抗，抗體用5%BSA按1∶200 稀釋）于室溫孵育1.5 h；PBS 泡洗后用DAPI 熒光封片劑避光封片20 min。熒光顯微鏡對切片上含有氣道的全部視野拍照（高倍鏡：×200）。統(tǒng)計小鼠氣道中Ki67+CCSP+細胞占CCSP+細胞的比例。

1.6 小鼠氣道Club細胞分離與鑒定 用7.5%水合氯醛溶液麻醉小鼠后，經(jīng)氣管插管注入彈性蛋白酶（4 U/mL，3 mL/只）消化肺組織；切碎肺組織，加入Dnase I 獲得單細胞懸液。600×g離心5 min后用預冷的漢克平衡鹽溶液（HBSS）重懸細胞，加入熒光標記的抗體CD24、EpCAM、Sca?1、CD31、CD34和CD45冰上孵育45 min；HBSS終止反應，加二抗（1∶100）于冰上孵育40 min；HBSS 終止反應，流式細胞儀分選CD31?CD34?CD45?EpCAM+CD24+Sca?1+Club 細胞，分選策略見圖1。

1.7 qPCR 法測定Club 細胞中 glucose?6?phosphate dehydro?genase X?linked（G6pdx）mRNA表達情況 按照1.3的方法重新建立12只小鼠模型（對照組6只，哮喘組6只）。第19天按1.6方法分選Club細胞，TRIzol法抽提細胞總RNA。取200 ng總RNA 反轉錄成cDNA。采用SYBR Green 實時熒光定量PCR 檢測目的基因mRNA 的表達。擴增程序為95 ℃3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)45次。分析 熔 解 曲 線 。G6pdx引 物 序 列 上 游 5'?CCACTC?CAGAAGAAAG ACCTAAG?3'，下游 5'?TGGCTGTTGAGGT?GCTTATAG?3'，內(nèi)參基因β-actin引物序列上游 5'?GGC?CAACCGTGAAAAGATGA?3'；下 游 5'?CAGCCTGGATGGC?TACGTACA?3'。待測樣本特定基因相對表達量的計算方法為2?ΔCt，樣本特定基因ΔCt=該基因循環(huán)閾值（Ct）?內(nèi)參基因（β?actin）Ct值。

Fig.1 Sorting strategy of mouse airway Club cells圖1 小鼠氣道Club細胞分選策略

1.8 類器官培養(yǎng)法研究6?AN 對Club 細胞克隆形成的影響 按照1.6 分選Club 細胞的方法分選2 只C57BL/6 小鼠的Club細胞。將分選出來的Club細胞和MLg細胞混合，離心棄上清后加DMEM/F12（每個小室按50 μL 計算）重懸細胞，用涼槍頭加入等比例的Matrigel 基質(zhì)膠，吹打混勻后接種到Transwell 小室中（每個小室接種3 000 個Club 細胞，2×105個MLg 細胞），構成3D 體外Club 細胞類器官培養(yǎng)模型。設0和10 μmol/L 6?AN兩組，每組5個復孔。接種后，在小室下面加410 μL 含0.1%Y27632 的干細胞培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，48 h 后吸干凈，分別加入含有0、10 μmol/L 6?AN的干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，每隔48 h 換液1 次。培養(yǎng)至第8天時用倒置顯微鏡進行觀察、拍照，測量并統(tǒng)計形成球狀結構的平均直徑和克隆形成數(shù)量（選取直徑大于50 μm的球狀結構計數(shù)）。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，2組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用Mann?WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 哮喘小鼠動物模型的建立 與對照組相比，哮喘組小鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹肌收縮和食欲減退等癥狀。抽取BALF后肉眼觀察，哮喘組的BALF明顯較對照組渾濁。BALF三色染色涂片的統(tǒng)計結果顯示，哮喘組BALF 中的總細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數(shù)明顯多于對照組（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of the number of different types of cells in BALF between the 2 groups表1 2組BALF中不同種類細胞數(shù)比較（n=6，×105個，）

Tab.1 Comparison of the number of different types of cells in BALF between the 2 groups表1 2組BALF中不同種類細胞數(shù)比較（n=6，×105個，）

＊P＜0.01

組別對照組哮喘組t總細胞1.11±0.72 12.99±3.04 9.307＊巨噬細胞0.73±0.68 0.82±0.50 0.258嗜酸性粒細胞0.02±0.02 9.70±2.64 8.977＊中性粒細胞0.20±0.16 2.08±0.94 4.831＊淋巴細胞0.15±0.15 0.39±0.30 1.747

2.2 OVA 誘導的哮喘對氣道Club 細胞增殖的影響 免疫熒光染色結果顯示哮喘組氣道中表達Ki67+CCSP+/CCSP+比例顯著高于對照組［11.43%（6.25%，17.57%）vs. 3.66%（2.50%，5.28%），n=6，Z=5.784，P＜0.01］，見圖2。

2.3 OVA 誘導小鼠哮喘Club 細胞中G6pdxmRNA的表達情況 哮喘組Club細胞G6pdxmRNA表達水平顯著高于對照組（0.008±0.002vs.0.005±0.001，n=6，t=3.353，P＜0.01）。

2.4 6?AN 對氣道Club 細胞克隆形成的影響 3D類器官培養(yǎng)結果顯示，Club 細胞克隆形態(tài)為中空的球體結構，10 μmol/L 6?AN 組Club 細胞的克隆直徑為（97.65±4.07）μm，顯著低于 0 μmol/L 6?AN 組的（208.01±10.28）μm（n=5，t=22.323，P＜0.01）；10 μmol/L 6?AN 組和 0 μmol/L 6?AN 組克隆形成數(shù)量分別為（150±12）個和（331±26）個，差異有統(tǒng)計學意義（n=5，t=13.555，P＜0.01），見圖3。

3 討論

Fig.2 The expression of CCSP and Ki67 in mouse lungs during OVA?induced asthma(immunofluorescence,×200)圖2 OVA誘導哮喘小鼠肺中CCSP和Ki67的表達（免疫熒光，×200）

Fig.3 The effect of 6?AN on the proliferation of Club cells圖3 6?AN對Club細胞增殖的影響

哮喘作為一種慢性氣道炎癥性疾病，人群患病率和死亡率高，已經(jīng)成為一種危害人類健康的全球性疾?。?］。哮喘患者氣道上皮損傷，氣道炎癥持續(xù)存在。有研究表明氣道上皮損傷修復受阻是炎癥持續(xù)存在的本質(zhì)原因［6?7］。本研究利用 OVA 致敏后霧化小鼠，反復驗證后發(fā)現(xiàn)，造模后的小鼠BALF 中總細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數(shù)量增高，與既往研究結果一致［8?10］，證明本研究中 OVA 誘導的小鼠哮喘模型具有穩(wěn)定性。氣道干（祖）細胞增殖可補充哮喘氣道上皮損傷后減少的細胞池，促進損傷的修復。近年來，對肺臟干細胞研究的增多和相關實驗技術的成熟為從提高氣道干（祖）細胞的增殖能力角度來治療哮喘提供了新思路。Club細胞是氣道上皮的重要祖細胞，能夠增殖并分化成纖毛細胞，在受到不利因素刺激后可分化成Goblet細胞［11?12］。氣道上皮損傷后是否能夠有效修復，與Club細胞的增殖功能密切相關。葡萄糖作為細胞代謝的主要能源物質(zhì)，主要通過葡萄糖轉運蛋白1（Glut1）轉運進細胞內(nèi)后被己糖激酶（HK）磷酸化，生成葡萄糖?6?磷酸（G6P）。G6P具有糖酵解或磷酸戊糖兩個代謝途徑，其對細胞生長和增殖發(fā)揮重要調(diào)控作用［13］。在OVA 誘導的小鼠模型中，氣道炎癥細胞顯著增多，OVA 霧化停止后，小鼠可逐漸恢復到正常水平。本研究發(fā)現(xiàn)，OVA 造模后的小鼠氣道中，Ki67+CCSP+Club 細胞增加，Club 細胞的增殖能力增強，這可能是機體的一種自我保護性機制，機體通過Club 細胞的增殖以修復哮喘所造成的氣道損傷，加速清除炎性細胞，進而恢復氣道環(huán)境的穩(wěn)定性。有研究表明，哮喘后糖酵解途徑增強［14］。筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)高濃度的糖酵解途徑抑制劑2?脫氧?D?葡萄糖（2?DG）抑制Club 的增殖［4］，與本研究一致，證明哮喘后Club 細胞增殖能力增強。G6PD 是磷酸戊糖途徑中的關鍵酶，本研究中，在OVA 誘導小鼠哮喘后G6pdx在Club 細胞中表達上調(diào)，說明哮喘小鼠中磷酸戊糖途徑增強。6?AN 是G6PD 的特異性抑制劑。本研究利用Club類器官體外培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)，6?AN 能減小Club 細胞形成類器官的直徑，降低Club 細胞類器官形成數(shù)量，說明阻斷磷酸戊糖途徑中的關鍵酶G6PD能抑制Club細胞的增殖。筆者之前的研究表明，博來霉素造成的肺纖維化小鼠中，抑制糖酵解或磷酸戊糖途徑均能抑制肺泡Ⅱ型上皮細胞（AT2）的增殖能力，干擾這兩條途徑也不利于博來霉素造成的肺泡上皮損傷后的修復［15］。這些研究提示，抑制G6PD 的活性不利于氣道和肺泡上皮損傷后的修復。

磷酸戊糖途徑可為機體提供還原型輔酶Ⅱ（NADPH）和核糖?5?磷酸，最終用于核酸的合成。細胞的抗氧化過程離不開谷胱甘肽（GSH）、NADPH途徑和谷胱甘肽還原酶的動態(tài)平衡［16］。哮喘患者的呼出氣中 NO 水平顯著增高［17］，G6PD 的增加很可能是機體為抵御NO氧化而發(fā)生的一種應激反應。

氣道上皮的完整性對維持氣道上皮的穩(wěn)態(tài)極為重要。氣道損傷后是否能成功修復取決于氣道干（祖）細胞的增殖和分化能力的動態(tài)調(diào)節(jié)。本研究著重于氣道祖細胞Club 細胞增殖能力的研究，6?AN對Club 細胞分化功能的影響需要進一步驗證。本研究存在的局限性：類器官模型是基于離體組織干（祖）細胞的功能調(diào)控，在哮喘小鼠模型中，體內(nèi)環(huán)境復雜，Club細胞增殖與分化命運受多種因素調(diào)控，可能與類器官模型研究結果不一致。葡萄糖代謝對Club 細胞的調(diào)控機制仍需要深入研究。綜上，本研究提示葡萄糖向磷酸戊糖途徑代謝對氣道Club 細胞增殖功能具有促進作用，從再生醫(yī)學角度揭示了哮喘與氣道Club細胞之間的關系，為探索以Club細胞為靶向的抗哮喘治療提供了新思路。