許雯，許永劼，劉歆蕾，沈婕，朱科靜，林海容，李興，潘衛(wèi)，△

糖尿病腦?。╠iabetic encephalopathy，DE）是由糖尿病引起的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及氧化應(yīng)激、炎癥損傷、細(xì)胞凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病引起的學(xué)習(xí)和記憶缺陷可能由海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)［1?3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高糖能誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元HT?22 細(xì)胞凋亡，且隨著糖濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著上升［4］。組蛋白乙?；揎椩谔悄虿〖捌洳l(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［5］，其在組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）和組蛋白去乙?；福℉DACs）的共同調(diào)控下能保持動(dòng)態(tài)平衡，且對(duì)基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮重要的作用。組蛋白乙?；c神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)［6］，HDACs SIRT6 能調(diào)控糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期神經(jīng)退行性病變［7］。但是，目前組蛋白乙?；贒E 中的作用尚不清楚。曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）是一種廣譜組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi），它能通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)組蛋白的乙?；潭日T導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8?9］。本研究利用TSA處理HT?22細(xì)胞，觀察HDACs對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，為研究DE的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 小鼠海馬神經(jīng)元HT?22 細(xì)胞（中喬新舟公司）；0.25%胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；胎牛血清（以色列BI 公司）；TSA（美國(guó)CST公司）；兔源β?肌動(dòng)蛋白（β?actin）多克隆抗體、兔源Bcl?2 相關(guān)X 蛋白（Bax）多克隆抗體、兔源B 淋巴細(xì)胞瘤?2（Bcl?2）多克隆抗體、兔源半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase?3）多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔抗體（武漢三鷹公司）；CCK8試劑盒（日本同仁公司）；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；RIPA高效裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Annexin V?FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司）；倒置相差顯微鏡（日本Nikon 公司）；Western blot 電泳儀、IMARK 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio?Rad公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取凍存的HT?22細(xì)胞于37 ℃水浴箱中復(fù)蘇，加入3 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，600 r/min，離心5 min，棄上清加入1 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT?22 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT?22 細(xì)胞分別用高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度55 mmol/L）及普通培養(yǎng)基（葡萄糖濃度25 mmol/L）培養(yǎng)，高糖培養(yǎng)基及普通培養(yǎng)基各分為2組：對(duì)照組（NC組）、抑制劑組（TSA組，加入TSA干預(yù)細(xì)胞）。

1.2.3 TSA 母液制備 取 1 mg TSA 溶于 826 μL DMSO 溶劑中，得到濃度為4 mmol/L 的TSA 母液，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋到相應(yīng)濃度，剩余放置于?20 ℃儲(chǔ)存。

1.2.4 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞存活率 待細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化細(xì)胞，以1×105/mL密度均勻接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分組按照1.2.2，同時(shí)另設(shè)置空白組（不含細(xì)胞僅含有培養(yǎng)基）；分別用1 mmol/L 的TSA作用TSA組細(xì)胞1、4、8 h，以及之后用0.4 mmol/L的TSA作用TSA組細(xì)胞1、4、8、12、14、16、20、24 h，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，用高糖培養(yǎng)基及普通培養(yǎng)基分別將TSA 母液稀釋成相應(yīng)濃度，以每孔100 μL 替換TSA 組原培養(yǎng)基；相應(yīng)作用時(shí)間結(jié)束，棄去各組培養(yǎng)基，每孔加100 μL檢測(cè)液（90 μL培養(yǎng)基+10 μL CCK8試劑），避光放于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中，反應(yīng)2.5 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的光密度（OD）值。細(xì)胞存活率=（TSA 組OD 均值?空白組OD 均值）（/NC 組OD 均值?空白組OD 均值）×100%。選擇最適的作用時(shí)間和濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的抑制劑作用條件。

1.2.5 ELISA 法檢測(cè)HADC 和HAT 活性 在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔、實(shí)驗(yàn)孔，實(shí)驗(yàn)孔分組按照1.2.2，用濃度為0.4 mmol/L的TSA作用TSA組20 h。標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL，實(shí)驗(yàn)孔加各組細(xì)胞裂解液各50 μL，空白孔不加；除空白孔外，其余孔各加HPR 標(biāo)記的山羊抗兔抗體100 μL，經(jīng)溫育、洗滌后，各孔加顯色劑 100 μL 避光反應(yīng)15 min 后，各孔加終止液50 μL。用空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)各孔OD 值，測(cè)定在加終止液后的15 min 內(nèi)完成，計(jì)算出樣品的濃度。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分組按照1.2.2，用濃度為0.4 mmol/L 的 TSA 作用 TSA 組 20 h 后收集細(xì)胞懸液，用 PBS洗 2 次，加入 500 μL Binding Buffer 重懸細(xì)胞，加入 5 μL Annexin V?FITC 混勻，再加入5 μL Propidium Iodide 混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，1 h以內(nèi)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl?2、Bax、Caspase?3表達(dá)情況 用濃度為0.4 mmol/L的TSA作用TSA組20 h后提取各組細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，用RIPA稀釋蛋白液，將各組蛋白濃度調(diào)至一致，按4∶1 體積加入5×loading buffer，混合液煮沸 10 min，使蛋白變性。以30 μg 為統(tǒng)一上樣量，濃度為12%的分離膠，通過(guò)SDS?PAGE 凝膠電泳分離目的蛋白，再將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，TBST 漂洗3 次，孵育一抗 β?actin（1∶5 000）、Bcl?2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Caspase?3（1∶2 000）于4 ℃搖床過(guò)夜，TBST 漂洗 3 次，每次 10 min，孵育二抗羊抗兔 IgG（1∶20 000）于室溫?fù)u床1.5 h。ECL法顯影，收集圖像，Image J軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSA 最適作用時(shí)間和濃度 CCK8 結(jié)果顯示，以1 mmol/L的TSA作用HT?22細(xì)胞1 h時(shí)，細(xì)胞存活率在80%左右；作用4 h 時(shí)，細(xì)胞存活率在60%左右；作用8 h時(shí)，細(xì)胞存活率＜50%。以0.4 mmol/L的TSA 作用 HT?22 細(xì)胞作用時(shí)間≤14 h 時(shí)，細(xì)胞存活率≥80%；作用16 h 時(shí)，普通培養(yǎng)基中細(xì)胞存活率為81%，高糖培養(yǎng)基中細(xì)胞存活率為73%；作用20 h時(shí)，高糖和普通培養(yǎng)基中的細(xì)胞存活率都在70%左右；作用24 h時(shí)，細(xì)胞存活率均＜50%。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以0.4 mmol/L、20 h為TSA最適作用條件，見(jiàn)圖1。

Fig.1 The effects of different action time on HT?22 cell activity圖1 TSA不同作用時(shí)間對(duì)HT?22細(xì)胞活性的影響

2.2 TSA 對(duì)不同糖濃度下HDAC 及HAT 活性的影響 在普通培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基中，TSA 組HDAC濃度較NC組均減少，HAT增加（P＜0.05）。同時(shí)，高糖作用后 NC 組和TSA 組的HDAC 和 HAT 增加（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.3 TSA 對(duì)不同糖濃度下HT?22 細(xì)胞凋亡率的影響 在普通培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基中，TSA組均較NC組細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05），且高糖培養(yǎng)基比普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡率更高（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表2。

Tab.1 The effects of TSA on HDAC and HAT activities of HT-22 cells under different concentrations of glucose表1 TSA對(duì)不同糖濃度下HT-22細(xì)胞HDAC和HAT活性的影響 （n=5，）

Tab.1 The effects of TSA on HDAC and HAT activities of HT-22 cells under different concentrations of glucose表1 TSA對(duì)不同糖濃度下HT-22細(xì)胞HDAC和HAT活性的影響 （n=5，）

＊P＜0.05

組別NC組TSA組t HDAC（pmol/L）普通培養(yǎng)基28.19±0.64 17.62±0.58 27.320＊高糖培養(yǎng)基61.17±1.67 53.27±1.06 8.912＊t 41.089＊65.936＊組別NC組TSA組t HAT（μg/L）普通培養(yǎng)基29.48±0.71 42.41±0.87 25.766＊高糖培養(yǎng)基33.94±1.09 45.32±0.66 19.940＊t 7.649＊5.960＊

2.4 TSA 對(duì)不同糖濃度下凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，在普通培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基中，NC 組與TSA 組Bax 表達(dá)均無(wú)顯著差異。TSA組均較NC組Bcl?2表達(dá)顯著下降，Caspase?3表達(dá)顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表3。

3 討論

DE是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，認(rèn)知功能障礙是其重要的臨床特征。糖尿病會(huì)增加阿爾茨海默病和血管性癡呆發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［10］。神經(jīng)元凋亡和海馬神經(jīng)受損是認(rèn)知/記憶功能障礙（包括阿爾茨海默?。┑闹饕蛩兀?1］。研究發(fā)現(xiàn)，大腦的肥大細(xì)胞作為腦損傷的“第一反應(yīng)者”在被激活后，會(huì)引起小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙［12］。另外，表觀遺傳機(jī)制已被證明對(duì)于調(diào)節(jié)神經(jīng)元基因表達(dá)至關(guān)重要，從突觸可塑性到學(xué)習(xí)和記憶，其在許多神經(jīng)元功能中扮演著重要的角色，特別是組蛋白乙?；谶@些過(guò)程中起重要作用［13］。HATs 和HDACs參與認(rèn)知功能的調(diào)控，不同HAT或HDAC的突變或失調(diào)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)變性。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC2在賴氨酸乙酰化與突觸可塑性偶聯(lián)中起核心作用，并在認(rèn)知障礙疾病中發(fā)揮重要作用［14］。同時(shí)，組蛋白乙酰化也影響神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；皆黾涌赏ㄟ^(guò)減少大腦皮層細(xì)胞凋亡及促進(jìn)神經(jīng)元再生保護(hù)新生大鼠大腦皮層損傷，其機(jī)制可能與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)增加相關(guān)［15］。本研究以小鼠海馬神經(jīng)元 HT?22 細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在高糖作用后細(xì)胞凋亡增加，并且HAT及HDAC也顯著增加。

Fig.2 The effect of TSA on apoptosis rate of HT?22 cells under different concentrations of glucose圖2 TSA對(duì)不同糖濃度下HT?22細(xì)胞凋亡率的影響

Tab.2 The effect of TSA on apoptosis rate of HT-22 cells under different concentrations of glucose表2 TSA對(duì)不同糖濃度下HT-22細(xì)胞凋亡率的影響（n=3，%，）

Tab.2 The effect of TSA on apoptosis rate of HT-22 cells under different concentrations of glucose表2 TSA對(duì)不同糖濃度下HT-22細(xì)胞凋亡率的影響（n=3，%，）

＊P＜0.05

組別NC組TSA組t普通培養(yǎng)基6.00±0.20 27.43±0.55 63.357＊高糖培養(yǎng)基20.57±0.78 47.97±2.16 20.680＊t 31.456＊15.958＊

Fig.3 The effect of TSA on the expression of Bcl?2,Bax and Caspase?3 in HT?22 cells under different concentrations of glucose圖3 TSA對(duì)不同糖濃度下HT?22細(xì)胞Bcl?2、Bax和Caspase?3表達(dá)影響

Tab.3 Comparison of TSA on the expressions of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in HT-22 cells under different concentrations of glucose表3 TSA對(duì)不同糖濃度下HT-22細(xì)胞Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)情況的比較 （n=3，）

Tab.3 Comparison of TSA on the expressions of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in HT-22 cells under different concentrations of glucose表3 TSA對(duì)不同糖濃度下HT-22細(xì)胞Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)情況的比較 （n=3，）

＊P＜0.05

組別NC組TSA組t普通培養(yǎng)基Bcl?2 1.16±0.06 0.46±0.02 19.729＊Bax 1.00±0.06 1.08±0.04 1.925 Caspase?3 0.84±0.06 1.07±0.06 4.903＊組別NC組TSA組t高糖培養(yǎng)基Bcl?2 0.78±0.02 0.45±0.01 27.494＊Bax 1.06±0.04 1.09±0.04 1.030 Caspase?3 0.99±0.05 1.29±0.03 8.395＊

TSA 是一種廣譜的 HDACi，屬于 HDACi 氧肟酸鹽類，可作用于Ⅰ、Ⅱ類HDAC。TSA 可通過(guò)上調(diào)Caspase?8、Caspase?3 和 BH3 相互作用域死亡激動(dòng)劑（Bid）等細(xì)胞中的促凋亡蛋白，下調(diào)Bcl?X1、髓樣細(xì)胞白血病蛋白?1（Mcl?1）和X 連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）等促進(jìn)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或通過(guò)線粒體介導(dǎo)的死亡途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡［16］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性，確定TSA 的最佳作用時(shí)間和濃度。TSA推薦的作用時(shí)間和濃度是12～18 h、0.4 mmol/L。但也有研究報(bào)道，通過(guò)CCK8 法確定TSA 處理肺腺癌A549細(xì)胞、肺鱗癌H520細(xì)胞的最適藥物濃度，即選取2.25～150 mmol/L間不同作用濃度，但是都是統(tǒng)一作用48 h，并沒(méi)有對(duì)時(shí)間進(jìn)行確定［17］。筆者先以1 mmol/L 的TSA 作用細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞活性的影響過(guò)大，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；之后又用0.4 mmol/L分別作用各組細(xì)胞1、4、8、12、14、16、20、24 h，發(fā)現(xiàn)在20 h時(shí)抑制效果明顯，且不影響細(xì)胞的存活。因此，最終選擇0.4 mmol/L，20 h為最適作用條件。

Wei 等［18］發(fā)現(xiàn) HDAC5 及其細(xì)胞內(nèi)易位是調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡的多種途徑的關(guān)鍵效應(yīng)因子。HDAC5均勻地分布于皮層神經(jīng)元的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)N?甲基?D?天冬氨酸（NMDA）誘導(dǎo)的細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，核內(nèi)的HDAC5 被快速磷酸化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，皮層神經(jīng)元中核定位的HDAC5 的異位表達(dá)抑制了NMDA 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在加入TSA 處理細(xì)胞后可抑制HDAC5對(duì)NMDA的作用，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡。本研究通過(guò)抑制HDAC，觀察組蛋白乙?；揎検欠裼绊懶∈蠛ｑR神經(jīng)細(xì)胞HT?22 的凋亡，并利用TSA作用于正常及高糖條件下培養(yǎng)的HT?22 細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞凋亡是否有影響。

組蛋白乙?；腿ヒ阴；谏窠?jīng)元老化、萎縮和退行性疾病中起重要作用。Wang 等［19］發(fā)現(xiàn)TSA可能通過(guò)抑制多巴胺能神經(jīng)元的存活率和增加其對(duì)神經(jīng)毒素的易感性參與帕金森的發(fā)病過(guò)程。Salminen等［20］發(fā)現(xiàn)TSA能影響大鼠小腦顆粒神經(jīng)元和小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的代謝，高水平的組蛋白乙酰化可誘導(dǎo)神經(jīng)元應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡發(fā)生。本研究中ELISA 結(jié)果顯示，TSA 作用后HDAC 活性降低，HAT活性增加；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率顯著增加，且在高糖條件下，細(xì)胞凋亡更嚴(yán)重；在蛋白水平上，TSA 能顯著下調(diào) Bcl?2 的表達(dá)，上調(diào)Caspase?3 的表達(dá)。這些結(jié)果表明TSA 可能通過(guò)抑制HDAC 增加組蛋白乙酰化水平，誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)元HT?22細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，TSA能誘導(dǎo)HT?22細(xì)胞的凋亡，并且在高糖條件下，TSA對(duì)HT?22細(xì)胞凋亡的影響更大。TSA可能通過(guò)增加組蛋白乙?；秸T導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而參與DE認(rèn)知功能障礙的機(jī)制。