廖惠云，吳洋，孫海平，葉遠青，王晨輝，曹毅，張華，朱懷遠

江蘇中煙工業(yè)有限責任公司，南京市建鄴區(qū)興隆大街29號210019

隨著公眾對吸煙與健康問題的日益關注，卷煙煙氣中釋放的特定物質成分已成為關注的焦點［1-4］。在卷煙煙氣中，存在著烯烴基苯類芳香物質，主要包含有丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、甲基異丁香酚等，其分子結構中以苯環(huán)上有烯丙基或丙烯基為基礎，鏈接有甲氧基或亞甲二氧基取代的官能團，該類化合物可能影響吸煙者的健康［5-6］。1964年，Rodgman等［7］收集多達0.5 kg的煙氣粒相物，分離鑒定出甲基丁香酚；2001年，Hoffmann等［8］公布的69種卷煙煙氣受關注成分清單中包含有甲基丁香酚；2002年，Rodgman等［9］對煙氣中已報道的有害成分進行了總結，認定卷煙煙氣中存在149種受關注成分，其中也包含甲基丁香酚。由此可見，煙氣中的甲基丁香酚一直受到科技工作者的廣泛關注。然而受限于煙氣中甲基丁香酚釋放量水平低，以及煙氣復雜基質對目標物的分析干擾嚴重等因素的影響，準確測定甲基丁香酚的釋放量是煙氣分析領域一項極具挑戰(zhàn)的工作［10］。

在國內外，甲基丁香酚在一些香料植物中常被鑒定和量化分析［11-14］，但是缺乏對煙氣中該成分的分析研究，僅有的報道是2000年Stephen等［15］采用固相萃取-GC/MS方法，對美國市場上銷售的卷煙煙氣中包含甲基丁香酚在內的8種烯烴基苯類芳香成分進行分析。但是基于對該方法的重復驗證結果發(fā)現(xiàn)，甲基丁香酚在文獻所采用的鍵合CN基團的固相萃取柱上保留性不強，達不到選擇性洗脫的目的，從而無法準確定量目標物。為解決量化分析甲基丁香酚帶來的技術挑戰(zhàn)，本研究中甄選出合適的反相固相萃取柱，選擇性洗脫目標物，再通過使用設計的雙填料反萃取裝置，從含大量水-有機溶劑溶液體系中反萃取目標物，進而采用GC/MS選擇離子監(jiān)測方法進行檢測，定量分析出煙氣中的甲基丁香酚，旨在為吸煙與健康研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

市售的28個國內外代表性品牌規(guī)格卷煙樣品（其中樣品1#～3#為混合型卷煙，樣品4#～28#為烤煙型卷煙）。

甲醇、乙醇、正己烷和二氯甲烷（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；甲基丁香酚（標樣，≥98%）、3",4"-（亞甲基二氧）苯乙酮（內標，≥98%）（比利時Acros公司）；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm，自制）；硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈣和中性氧化鋁（AR，使用前均經高溫活化處理，國藥集團化學試劑有限公司）；4?分子篩（使用前經高溫活化處理，淄博齊創(chuàng)新材料科技有限公司）。

RM20H轉盤式自動吸煙機（德國Borgwaldt KC公司）；6890N/5975C氣相色譜-質譜儀（配備7683自動進樣器、增強型化學工作站，美國Agilent公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；AL204電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；HY-8回旋式振蕩器（常州國華電器有限公司）；硅膠固相萃取柱（500 mg/6 mL）、Florisil固相萃取柱（1 g/6 mL）、氨基固相萃取柱（500 mg/6 mL）、氰丙基固相萃取柱（1 g/6 mL）、C18固相萃取柱（2 g/10 mL）、聚丙烯空柱管（帶篩板/60 mL）（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

1.2.1.1 內標溶液

準確稱取100 mg 3",4"-（亞甲基二氧）苯乙酮，用乙醇定容至100 mL，配制成濃度為1 mg/mL的內標儲備液；準確移取100μL內標儲備液，用乙醇定容至100 mL，配制成濃度為1μg/mL的內標溶液。

1.2.1.2 標準系列溶液

一級標準儲備液：準確稱取100 mg甲基丁香酚，用乙醇定容至100 mL，濃度為1 mg/mL；二級標準儲備液：準確移取1 mL一級標準儲備液，用乙醇定容至100 mL，濃度為10μg/mL。

標準系列溶液：分別準確移取二級標準儲備液10、20、50、100、200和400μL，以及內標溶液各1 mL，用乙醇定容至10 mL容量瓶中。該系列標準溶液目標物濃度分別為10、20、50、100、200和400 ng/mL，其中內標濃度為100 ng/mL。

1.2.2 樣品分析

1.2.2.1 樣品萃取

按照GB/T 19609—2004［16］的要求收集20支卷煙的總粒相物。將捕集總粒相物的玻璃纖維濾片置于100 mL錐形瓶中（濾片應整片放入錐形瓶，鋪平，不能剪碎或撕碎），準確加入40 mL甲醇，置于回旋式振蕩器內，于160 r/min條件下振蕩萃取40 min，靜置。

1.2.2.2 萃取液凈化

準確移取20 mL萃取液至濃縮瓶中，在70℃、常壓下旋轉蒸發(fā)至約1 mL，加入4 mL水，混合均勻形成乳化液，視為上樣液。接著對上樣液進行固相萃?。⊿PE）處理，具體步驟：用5～10 mL甲醇活化C18鍵合的SPE小柱，排干溶劑，再用10 mL水對SPE小柱進行平衡；然后移取全部上樣液至SPE小柱上，待上樣液流出SPE小柱后，分兩次用20 mL 50%（體積分數(shù)）甲醇水溶液洗滌濃縮瓶，一并轉移至SPE小柱內，棄去淋洗液；接著用10 mL 70%的甲醇水溶液洗脫，洗脫速度保持在1～2 mL/min，收集所有洗脫液，得凈化液。

1.2.2.3 凈化液反萃取

在一聚丙烯空柱管里，先加入6 g無水硫酸鎂，再加入22 g無水硫酸鈉，用吸耳球輕輕敲打，使其裝填充實、均勻，然后對凈化液中的目標物進行反萃取。具體步驟：加入10 mL二氯甲烷，使雙填料物浸潤；然后移入上述凈化液，待凈化液全部遷移進填料中時，用10 mL二氯甲烷洗滌盛裝凈化液的玻璃器皿，洗滌液全部轉移至空柱管內，并用60 mL二氯甲烷分3次洗脫，使用雙聯(lián)球適當加壓，收集緩慢流下來的溶液，得到反萃取液。

1.2.2.4 反萃取液濃縮及儀器分析

在反萃取液中加入100μL二級內標溶液，于40℃、常壓條件下濃縮至約1 mL，進行GC/MS分析。分析條件：

色譜柱：DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；進樣口溫度：250℃；進樣量：1μL；分流方式：脈沖不分流；升溫程序：60℃280℃（5 min）；傳輸線溫度：280℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；檢測方式：選擇離子監(jiān)測（SIM）；目標離子：甲基丁香酚的特征離子為m/z 178、m/z 163和m/z 147（其中m/z 178為定量離子），內標的特征離子為m/z 164、m/z 149和m/z 121（其中m/z 149為定量離子），對每個離子的監(jiān)測時間為100 ms；溶劑延遲時間：6 min。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

2.1.1 主流煙氣捕集方式確定

卷煙煙氣包括粒相和氣相兩部分，玻璃纖維濾片所捕集的僅是煙氣的粒相部分。為了考察玻璃纖維濾片捕集主流煙氣中甲基丁香酚的效率，利用其捕集主流煙氣粒相物的同時，在濾片后串聯(lián)兩個盛有20 mL甲醇的吸收瓶，用于吸收主流煙氣氣相部分的甲基丁香酚。按照上述樣品處理方法，抽吸20支卷煙，然后分別檢測玻璃纖維濾片和吸收液中的甲基丁香酚。結果表明，玻璃纖維濾片捕集的甲基丁香酚的量為3.14 ng/支，而在兩個吸收瓶的吸收液中均未檢出甲基丁香酚。這說明主流煙氣中的甲基丁香酚主要存在于粒相物中。因此，采用玻璃纖維濾片可以較為完全地收集卷煙主流煙氣中的甲基丁香酚。

2.1.2 固相萃取柱填料選取

通過甲醇萃取煙氣粒相物得到的萃取液，由于樣品基質復雜，干擾嚴重，再加上甲基丁香酚的質量分數(shù)處于納克級水平，如果對其直接進樣分析或濃縮富集后進樣分析，在色譜圖中根本無法準確找到目標物。為此，在進樣分析前必須先對萃取溶液進行凈化處理，以排除基質干擾。在參考文獻［17］的基礎上，按照極性由大到小的順序，依次選擇硅膠固相萃取柱、Florisil固相萃取柱、氨基固相萃取柱、CN固相萃取柱和C18固相萃取柱為對象，考察目標物的保留情況，以便甄選出合適的填料，達到選擇性洗脫甲基丁香酚的目的。圖1a～圖1e分別是以標樣溶液為上樣液，得到的淋洗液（上樣后不加洗脫溶劑時，從柱子下篩板流下的液體）和洗脫液（加洗脫溶劑時，從柱子下篩板流下的液體）中目標物提取離子色譜圖。

從圖1中可知，極性強的硅膠、Florisil固相萃取小柱，對甲基丁香酚基本沒有保留；極性適中的氨基小柱對目標物的保留也不強，極性適中的氰丙基小柱對目標物有部分保留作用，但淋洗液中目標物的質量分數(shù)還是遠大于洗脫液中，這說明該類型小柱對目標物的保留也不佳；極性弱的反相C18小柱對目標物的保留最好，洗脫液中目標物的質量分數(shù)遠大于淋洗液中，前者峰面積占整個目標物總峰面積的比例大于99%。事實上，從原理上進行分析，便能理解C18反相柱對目標物具有較好的保留作用：物理特性數(shù)據表明，甲基丁香酚的辛醇-水分配系數(shù)lgKOW為2.97。一般說來，按照lgKOW值分類大小原則，當lgKOW值＞1時，物質呈現(xiàn)弱極性，lgKOW值越大，其極性越弱。根據相似相容原理，極性弱的C18反相柱理論上與目標物具有較強的相互作用力，進而對目標物有較好的保留作用?；诖?，確定C18固相萃取小柱作為樣品萃取液的凈化柱。

2.1.3 固相萃取淋洗條件的優(yōu)化

為了盡可能地排除煙氣基質干擾，需對萃取液進行SPE凈化處理。上樣后，部分干擾物會與目標物同時保留在吸附劑上，這些干擾物中的一部分與吸附劑的作用力弱于目標物，而另一部分則強于目標物，所以在保證回收率要求的情況下，在增加淋洗液洗脫強度以最大程度洗掉保留性能弱的干擾物的同時，盡量降低洗脫液洗脫強度以最大限度使保留性能強的干擾物留在吸附劑上。為此，以標樣溶液為上樣液，分別用體積分數(shù)為5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的甲醇水溶液洗脫，各自收集洗脫液進行分析，建立淋洗曲線，以探討淋洗液和洗脫液的合適濃度。目標物在C18柱子上的淋洗曲線見圖2。可以看出，當甲醇濃度低于40%時，甲基丁香酚仍保留在柱子上，沒有被洗脫下來；當濃度增加至50%時，有低于3%的目標物被洗脫下來，總的來看，洗脫能力還不是很強；當濃度增加至60%時，95.42%的目標物被洗脫下來；當濃度繼續(xù)增加至70%時，98.68%的目標物被洗脫下來；隨甲醇濃度繼續(xù)增加，溶劑的洗脫能力更強，目標物基本全被洗脫下來。依據上述淋洗溶劑和洗脫溶劑極性強度選取的原則，在保證目標物回收率較好的情況下，選取50%甲醇水溶液為淋洗溶劑，選取70%甲醇水溶液為洗脫溶劑。在此基礎上，以實際樣品為分析對象，進一步優(yōu)化并確認淋洗溶劑用量為20 mL、洗脫溶劑用量為10 mL。

圖1 不同SPE小柱條件下淋洗液和洗脫液中目標物的色譜圖Fig.1 Quantitative ion chromatograms of methyleugenol in rinsing solution and elution solution by using SPE sorbents of silicone

圖2 目標物在C18柱上的淋洗曲線圖Fig.2 Elution curve of methyleugenol by n-octadecane SPE

2.1.4 洗脫液除水反萃取的確定

經過C18SPE柱得到的凈化液中含有一定量的水，理論上略大于洗脫溶劑中水的濃度（即大于30%）。在進行GC/MS分析前，必須進行溶劑轉換，即采取相應的辦法除去洗脫液中的水，選用合適的有機溶劑反萃取目標物，以避免水對目標物響應以及對色譜柱和質譜系統(tǒng)帶來負面影響。為此，選取合適的溶劑轉換辦法就顯得尤為重要。綜合考慮到含水量較高以及目標物的質量分數(shù)極低，設計如圖3所示的除水反萃取裝置，并考察了硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈣、中性氧化鋁以及分子篩等對目標物出峰情況的影響。發(fā)現(xiàn)中性氧化鋁以及分子篩對凈化液的除水效果不佳，而氯化鈣在甲醇環(huán)境下因會與其反應而不適宜除水。因此，確定選擇硫酸鈉和硫酸鎂共同除水。依據硫酸鈉吸水速度慢、吸附量大，以及硫酸鎂吸水速度快、吸附量相對小的特點，將裝置中的上填料確定為硫酸鈉，下填料確定為硫酸鎂。通過組合使用，充分發(fā)揮填料吸水特性，確保能夠從含水量大的有機溶劑中反萃取出痕量的目標物。

使用該裝置的反萃取過程為：先用二氯甲烷浸潤雙填料，使二氯甲烷充滿整個雙填料體系內；再添加洗脫液（約70%的甲醇水溶液），大部分水被上填料硫酸鈉吸收，剩余的水被下填料硫酸鎂快速吸收；同時，二氯甲烷因其密度比水大，夾帶著甲醇慢慢從篩板下流出來；最后，使用大量的二氯甲烷進行淋洗，采用雙聯(lián)球略微加壓，使目標物被溶劑淋洗下來，達到從含水量大的有機溶劑體系中反萃取痕量目標物的目的。

圖3 洗脫液中除水反萃取裝置示意圖Fig.3 Schematic diagram of reverse extraction device for absorbing water in eluate

2.1.5 反萃取雙填料使用量的優(yōu)化

在優(yōu)化洗脫液除水反萃取裝置中，發(fā)現(xiàn)雙填料的用量對反萃取效果影響明顯：如果填料中硫酸鈉用量過多、硫酸鎂用量過少，使得含少量水的凈化液不能快速被吸收而流出篩板，反萃取液中還含有微量的水分；如果填料中硫酸鈉用量過少、硫酸鎂用量過多，可使溶液體系內硫酸鎂因吸水急劇放熱，下填料會形成堅硬的塊狀固體，嚴重影響凈化液的流出速度。為此，必須優(yōu)化雙填料的使用量。在前期反復實驗的基礎上，以10#卷煙樣品為對象，按照表1所示的用量配比對填料用量進行優(yōu)化。從結果（圖4）可以發(fā)現(xiàn)，對于本樣品前處理萃取液凈化過程得到的凈化液而言，硫酸鈉-硫酸鎂用量配比存在一個較好的平衡點，在m（硫酸鈉）:m（硫酸鎂）=22:6時，既能保證洗脫液以一定流速從填料中流出，又能使得目標物的反萃取效果最優(yōu)。因此，最終選擇m（硫酸鈉）:m（硫酸鎂）=22:6為雙填料用量。

2.2 儀器分析條件選擇

2.2.1 色譜進樣方式的優(yōu)化

基于目標物的痕量水平，為提高其響應情況，可使用脈沖進樣模式，以提高實際進入色譜柱的樣品量，減少其在進樣口分解的機會，同時使樣品更集中地進入色譜柱從而提高檢測靈敏度［18］。為此，在保持其他色譜分析條件不變的情況下，研究了不同進樣方式下目標物響應情況的變化，結果術分析煙氣樣品時，必須優(yōu)選質譜特征離子。目標物甲基丁香酚的質譜圖顯示，其分子離子［M］+也是豐度最大的基峰離子為m/z 178，緊隨其后的特 征 離 子 為m/z 163［M-CH3］+和m/z 147［M-OCH3］+，三者的豐度比為100:34:33；內標物3",4"-（亞甲基二氧）苯乙酮的質譜圖顯示其分子離子［M］+為m/z 164，緊隨其后的特征離子為m/z 149［M-CH3］+，這也是豐度最大的基峰離子，再隨其后的特征離子為m/z 121［M-CO-CH3］+，三者的豐度比為51:100:36。依據特征離子的選擇應符合m/z大、相對豐度高、干擾離子少等原則，確定甲基丁香酚的定量離子為m/z 178，輔助定性離子為m/z 163和m/z 147；內標物的定量離子為m/z 149，輔助見圖5?？梢钥闯?，4種進樣方式下，目標物和內標的出峰情況均較好，峰形對稱，基線完全分離。不分流（含脈沖）相比于分流（含脈沖）而言，前者的峰面積均大10倍多，與分流比大小基本相符合，同時信噪比也大3～4倍。進一步分析可知，在不分流條件下，相比于單純的不分流，脈沖不分流條件下目標物和內標的峰面積和信噪比均比后者大。為此，考慮到目標物的整體出峰狀況，優(yōu)選脈沖不分流為色譜進樣方式。

表1 不同填料用量對目標物反萃取的影響Tab.1 Effects of different usages of packing materials on reverse extraction of target compounds

圖4 不同填料用量下目標物色譜圖Fig.4 Quantitation ion chromatograms of methyleugenol at different ratios of packing materials

2.2.2 質譜特征離子的確定

基于卷煙煙氣化學成分復雜、基質干擾嚴重及目標物釋放量較低等因素，在使用SIM-GC/MS技定性離子為m/z 164和m/z 121。

圖5 不同進樣方式下目標物（a）和內標（b）的提取離子色譜圖Fig.5 Quantitation ion chromatograms of methyleugenol(a)and internal standard(b)in different injection modes

2.3 方法評價

2.3.1 工作曲線、檢出限和定量限

將系列標準工作溶液進行GC/MS分析，求得線性回歸方程及其相關參數(shù)。從表2可知，目標物在10～400 ng/mL濃度范圍內（換算成煙支質量分數(shù)為1.00～40.0 ng/支）線性關系良好（回歸方程的R2為0.999 5）。用最低濃度標樣作為未知樣品，重復進樣10次，計算標準偏差。分別以3倍和10倍標準偏差計算方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。LOD和LOQ分別為0.24和0.81 ng/支，遠低于文獻［15］的報道值（其檢測限為5.1 ng/支），能夠滿足卷煙煙氣中甲基丁香酚的檢測要求。

表2 方法的工作曲線及線性范圍、檢出限和定量限Tab.2 Calibration curve,limit of detection,and limit of quantitation of the method

2.3.2 精密度

以14#卷煙樣品為分析對象，分別進行日內和日間精密度實驗，分別計算6次平行測定結果的相對標準偏差（RSD）。表3結果顯示，方法的日內RSD＜7%，日間RSD＜9%。對于痕量物質分析而言，該方法精密度較好。

表3 方法的精密度Tab.3 Precision of the method （ng·支-1）

2.3.3 回收率

同樣以14#卷煙樣品為對象，進行低、中、高3個不同濃度水平的加標實驗，然后按照上述前處理步驟處理，再進行GC/MS分析，計算其加標回收率。從表4可知，目標物的回收率在97.2%～114.5%之間。表明該方法的回收率較好。

表4 方法的回收率Tab.4 Spiked recoveries of the method

2.4 卷煙樣品的測定

采用本方法分析28個卷煙樣品的結果見表5。可知，在所測卷煙樣品中，主流煙氣甲基丁香酚的釋放量范圍為2.24～5.13 ng/支，其中混合型卷煙的釋放量范圍為2.46～3.52 ng/支，烤煙型卷煙的釋放量范圍為2.24～5.13 ng/支。從單位焦油釋放量來看，混合型卷煙主流煙氣中單位焦油甲基丁香酚釋放量范圍為0.45～0.82 ng/支，烤煙型卷煙的釋放量范圍為0.22～0.47 ng/支。綜上，混合型卷煙主流煙氣中甲基丁香酚的釋放量與烤煙型卷煙相差不大，但對于單位焦油甲基丁香酚釋放量而言，前者遠高于后者。這與文獻［19］中所述的丁香酚的釋放規(guī)律一致，可能是因為該兩個化合物均屬于烯烴基苯類物質，主要來源于煙草中木質素燃燒產生的轉移［7］。此外，值得說明的是，如若采用文獻［15］的方法，其檢測限為5.1 ng/支，遠大于多數(shù)卷煙樣品的實際釋放量，根本無法檢測出卷煙樣品主流煙氣中目標物的釋放量，這也體現(xiàn)出本方法的優(yōu)越性。

表5 28個不同品牌卷煙主流煙氣中甲基丁香酚的釋放量Tab.5 Releases of methyleugenol in mainstream cigarette smoke of 28 cigarette brands

3 結論

①建立了采用固相萃取凈化-雙填料反萃取-氣相色譜/質譜法分析卷煙主流煙氣中甲基丁香酚釋放量的方法。②目標物在10～400 ng/mL濃度范圍內線性良好，R2為0.999 5，日內和日間相對標準偏差分別為6.86%和8.73%，樣品加標回收率在97.2 %～114.5 %之間，方法的檢出限為0.24 ng/支，定量限為0.81 ng/支，本方法明顯優(yōu)于現(xiàn)有的國外文獻報道結果。③部分樣品普查結果表明，混合型卷煙煙氣甲基丁香酚的釋放量范圍為2.46～3.52 ng/支，烤煙型卷煙煙氣釋放量范圍為2.24～5.13 ng/支，其中前者單位焦油中的釋放量遠高于后者。本方法可以準確測定煙氣中的甲基丁香酚釋放量，可為有關吸煙與健康研究提供科學依據。