鄒 敏，蹇 川，李文俊

（重慶市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，重慶 401147）

關(guān)鍵字：葉綠素a；方法；探討

湖泊富營養(yǎng)化已成為最重要的水環(huán)境問題之一，葉綠素a是反映富營養(yǎng)化的重要指標(biāo)，一級生態(tài)區(qū)湖泊營養(yǎng)主要考慮湖泊生態(tài)系統(tǒng)受氣候和地理因素的影響。對于湖庫樣品，葉綠素a是判定湖庫水質(zhì)好壞的重要指標(biāo)之一，是衡量藻類生物量的最重要指標(biāo)，與總氮、總磷有直接關(guān)系[1]。湖庫的富營養(yǎng)化也叫水華，在外觀上主要表現(xiàn)為水體呈紅色、棕色等。一般來說，水體富營養(yǎng)化后，透明度會降低，厭氧條件會產(chǎn)生有害氣體，進(jìn)而傷害水體里的生物，導(dǎo)致水生物種類減少，水生態(tài)系統(tǒng)被破壞。

本文以水體中葉綠素a的含量為例，探討葉綠素a測定時間的相關(guān)影響因素。在采樣時，應(yīng)在500 mL或1 000 mL的棕色采樣瓶中加入碳酸鎂懸濁液，碳酸鎂溶液的加入，以每升水樣加入1 mL為宜，主要是為了防止酸化引起色素沉淀。樣品采回后，應(yīng)冷藏避光存放，并盡快分析，其主要原理是將樣品過濾后，通過丙酮提取，并將提取液離心后，用分光光度計進(jìn)行測定吸光度，根據(jù)吸光度計算樣品含量。

在《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB2002-3838）中并沒有葉綠素a的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)濟合作與發(fā)展組織規(guī)定，3 μg/L以下的是貧營養(yǎng)，11～78 μg/L的是富營養(yǎng)，78 μg/L以上的是重富營養(yǎng)。要想控制好水質(zhì)，消除水華現(xiàn)象，最重要的就是監(jiān)控好葉綠素a的質(zhì)量濃度[2]。因此，監(jiān)控好葉綠素a的水質(zhì)狀況，對湖庫水環(huán)境質(zhì)量的提升意義重大。

1 實驗條件探究

我們嚴(yán)格按照河湖岸線進(jìn)行保護，高標(biāo)準(zhǔn)推進(jìn)“兩江四岸”生態(tài)修復(fù)、濱水空間建設(shè)要求，要使湖庫水質(zhì)變好，分光光度法測定葉綠素a是最重要的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，750 nm處吸光度應(yīng)小于0.005。本文通過對研磨方法、不同分光光度計的型號、濾膜型號的對比等，得出了最佳實驗條件。為了得出最具說服力的數(shù)據(jù)，應(yīng)在不同采樣季節(jié)、不同采樣溫度、不同采樣條件下，采用同樣的監(jiān)測方法得出不同的數(shù)據(jù)，并研究了750 nm處吸光度值的差異。在研磨時，放置于組織研磨器中研磨，其優(yōu)于玻璃研磨器研磨，并分三次加入丙酮溶液，研磨后離心機的轉(zhuǎn)速也會影響提取結(jié)果，浸泡提取時應(yīng)定容至10 mL，用錫箔紙包裝好，冷藏2～24 h；在抽濾時，采用玻璃纖維濾膜，輕輕顛倒混勻樣品，在完全抽濾后，將濾膜對折，用濾紙吸干，如不能及時分析，應(yīng)將濾膜冷凍存放在冰箱，并于14 d內(nèi)分析完畢。

1.1 儀器、材料及試劑的準(zhǔn)備

本次實驗用到的試劑主要有90%的丙酮溶液、碳酸鎂懸濁液、有機相針式濾器、0.45 μm濾膜、離心機、抽濾器、1 cm比色皿、離心管、鋁箔紙；儀器主要包含紫外可見分光光度計UV-2600、離心機、震蕩提取儀，所用試劑為Anrqur Chemicals Supply的丙酮、成都市科隆化學(xué)品有限公司的碳酸鎂等[3]。

各種葉綠素之間的差別在于和吡咯環(huán)相連接的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)有所不同。葉綠素a和葉綠素b的區(qū)別在于第Ⅱ吡咯環(huán)上第三碳位上的取代基R′的不同。葉綠素分子的上端金屬卟啉環(huán)中，鎂原子偏向于帶正電荷，而氮原子帶負(fù)電荷，呈極性，因而具有親水性。葉綠素不溶于水，但溶于乙醇、丙酮、和石油醚等有機溶劑。大多數(shù)植物體中葉綠素a的含量比葉綠素b的含量多2～3倍。

1.2 方法檢出限和測定下限測試數(shù)據(jù)

對于采用低濃度的樣品，在裝好玻璃纖維濾膜的過濾裝置上進(jìn)行抽濾，用少量蒸餾水沖洗器壁，在抽濾結(jié)束后，用鑷子將濾膜取出，對折，用濾紙吸干，將濾膜置于研磨裝置中，加入3～4 mL丙酮，研磨至糊狀，并重復(fù)1～2次，保證充分研磨5 min以上，并將完全研磨的提取液轉(zhuǎn)移至玻璃刻度離心管中，用丙酮溶液沖洗研缽及研缽棒，一并轉(zhuǎn)入離心管中，定容至10 mL，將離心管放入離心機，以相對離心力4 000 r/min離心10 min，然后用針式濾器過濾上清液得到葉綠素a的丙酮提取液，以丙酮作參比，在波長750、664、647、630 nm處測量吸光度，平行測定7次，如表1所示。

表1 方法檢出限和測定下限測試數(shù)據(jù)

1.3 方法精密度測試數(shù)據(jù)

采集兩種不同濃度的水樣按照標(biāo)準(zhǔn)方法分別進(jìn)行6次測定，其測試數(shù)據(jù)見表2。

表2 方法精密度測試數(shù)據(jù)

1.4 實際樣品測試數(shù)據(jù)

實際樣品測試數(shù)據(jù)見表3。

表3 實際樣品測試數(shù)據(jù)

1.5 方法驗證結(jié)論

在本次驗證方法中，實驗驗證人員對該標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了學(xué)習(xí)培訓(xùn)，實驗室所用儀器設(shè)備均在檢定有效期內(nèi)，在實驗過程中均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的試劑，實驗環(huán)境滿足方法要求，未受到其它項目干擾。750 nm吸光度小于0.005，滿足標(biāo)準(zhǔn)要求；實驗所得方法檢出限為1 μg/L，測定下限為4 μg/L，小于方法檢出限2 μg/L的要求；精密度、實際樣品滿足分析要求。實驗室檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，人員操作熟練，技術(shù)水平符合要求，已滿足該方法的各項條件。

2 方法注意事項

在采樣時要注意采集平行樣，實驗時按照10%的平行雙樣，當(dāng)樣品數(shù)量在20個以內(nèi)時應(yīng)有一個實驗室空白，平行雙樣的相對誤差應(yīng)小于20%。在運輸采集樣品的過程中應(yīng)避免樣品被玷污、損失和丟失；在樣品交接和發(fā)放環(huán)節(jié)，應(yīng)確保無遺漏，保證樣品與標(biāo)簽的一一對應(yīng)，并符合相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。葉綠素a的結(jié)果與采樣量有關(guān)，當(dāng)為中營養(yǎng)或富營養(yǎng)時，最小過濾體積取100～200 mL，當(dāng)為貧營養(yǎng)時，最小過濾體積取500～1 000 mL，采樣用棕色玻璃瓶，采樣時加入的碳酸鎂懸濁液以1.0 g碳酸鎂加入100 mL去離子水進(jìn)行配制，使用前應(yīng)充分搖勻。丙酮應(yīng)采用分析純或色譜純，濾膜為玻璃纖維濾膜，在抽濾時負(fù)壓不超過50 kpa，抽濾完后需用去離子水沖洗濾膜。

將過濾后的濾膜放置于玻璃離心管中，加入10.0 mL丙酮溶液，在振蕩器中，以3 000 Hz震蕩5 min，待充分震蕩搖勻后，將離心管用鋁箔包好，并放置于4 ℃冰箱中冷藏[4]。在浸泡過程中要注意反復(fù)顛倒搖勻2～3次，冷藏時間不宜超過24 h，達(dá)到冷藏時間后要以濾膜過濾，用在分光光度計測定濾液的吸光度，在分析過程中，特別需要注意的是，750 nm的波長應(yīng)小于0.005。

在監(jiān)測時丙酮有一定危害，要注意防止皮膚接觸，在通風(fēng)櫥中操作，所使用的比色皿和玻璃器具不應(yīng)用酸浸泡或洗滌。葉綠素的實驗房間應(yīng)避光，如果750 nm波長處的吸光度值大于0.005，應(yīng)重新過濾，重復(fù)操作，直至吸光度值小于0.005，在測定時，應(yīng)將分光光度計置于通風(fēng)櫥中，保證人體不受危害。

如果不采用震蕩提取儀，而采用玻璃研磨器的話，樣品在流轉(zhuǎn)過程中會有所損失，而且丙酮危害極大。在研磨過程中應(yīng)防止丙酮揮發(fā)，實驗分析中應(yīng)帶上全程序空白樣和實驗室空白樣。測定結(jié)果報整數(shù)，并且不超過三位有效數(shù)字。完善三級審核，嚴(yán)格按照數(shù)據(jù)處理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行計算，記錄測定數(shù)值時，應(yīng)同時考慮計量器具的精密度、準(zhǔn)確度和讀數(shù)誤差，對檢定合格的計量器具，最多保留一位不確定數(shù)字。精密度一般只取1～2位有效數(shù)字，在審核報告時應(yīng)對采樣、分析環(huán)節(jié)進(jìn)行逐一審核，通過對采樣狀況、歷史數(shù)據(jù)情況、邏輯關(guān)系、連續(xù)多次監(jiān)測結(jié)果的數(shù)據(jù)比較，對不符合或異常的數(shù)據(jù)要進(jìn)行合理分析，在監(jiān)測結(jié)果低于方法檢出限時，用2 L表示，報告審核完畢后，按照報告管理和發(fā)放程序進(jìn)行歸檔管理。