楊安納，王吟，楊東升，周艷萍，涂晶，盧佳，李茜，施金榮，王澤鋆，申碩

武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北武漢430207

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）引起的新型呼吸道傳染病。截至2021 年1月中旬，全球累計(jì)新冠確診病例超過9 319 萬，死亡病例達(dá)201 萬以上，現(xiàn)仍以每天新增68 萬感染病例的速度增長，尚無特效藥，接種安全有效的疫苗建立群體免疫是遏制該病毒傳播的最佳手段。目前，全球已有多種新冠疫苗進(jìn)入臨床研究，包括重組載體、DNA、脂質(zhì)納米顆粒mRNA、滅活病毒、減毒活病毒和蛋白質(zhì)亞基疫苗等［1］。據(jù)WHO 統(tǒng)計(jì)，截至2020年12 月29 日，全球共有190 多個候選疫苗正在研發(fā)，其中50 多個已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，15 個已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)［2］。

滅活劑 β-丙內(nèi)酯（β-propiolactone，BPL）直接與病毒核酸分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤作用［3］，引起單鏈斷裂或雙螺旋鏈交聯(lián)而達(dá)到滅活病毒的作用。與甲醛比較，BPL 對病毒具有更強(qiáng)的滅活作用，同時不破壞病原體蛋白的免疫原性；還可降低生物制品中殘留宿主細(xì)胞DNA 的含量，并具有極易水解成無毒無害物質(zhì)的特性，目前在國外應(yīng)用于多種疫苗的滅活［4-6］。武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司在新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）研發(fā)中，以BPL 作為滅活劑，對烈性傳染病病原體進(jìn)行兩步滅活，滅活效果更徹底，確保生產(chǎn)及接種使用的安全性。但BPL可引起堿基烷基化或?；瑢?dǎo)致DNA 損傷，如去嘌呤突變，并發(fā)生A 至T 轉(zhuǎn)位。在實(shí)驗(yàn)動物中，即使單次給藥，BPL 也顯示出高度致瘤性、遺傳毒性和致癌性［7］。因此以其作為滅活劑進(jìn)行疫苗生產(chǎn)時需對其殘留進(jìn)行工藝驗(yàn)證，確保符合國家疫苗質(zhì)量監(jiān)管部門的要求。目前BPL 殘留的檢測方法有高效液相色譜法和氣相色譜法［8-10］。本研究針對新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）中BPL 殘留量建立氣相色譜檢測方法，并進(jìn)行專屬性、檢測限、定量限、線性范圍、重復(fù)性和耐用性驗(yàn)證，為病毒滅活驗(yàn)證工藝及質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疫苗濃縮液及原液 新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）濃縮液（批號：202009Z001）及該疫苗原液（批號：202005Y009、202005Y010、202005Y011）由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司制備。

1.2 主要試劑及儀器 BPL 對照品（含量：1.146 g／mL）購自德國SERVA 公司；乙腈（色譜級，純度為99.9%）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Agilent DB-624 毛細(xì)管柱（30 m × 0.250 mm × 1.40 μm）和氣相色譜儀（型號：Agilent 7890A）均購自美國Agilent 公司。

1.3 方法的建立 氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度為180 ℃，分流比為2 ∶1，載氣為氮?dú)?，檢測器溫度為250 ℃，運(yùn)行時間為 10 min［11］。

1.4 方法的優(yōu)化

1.4.1 柱溫條件的選擇 分別采用升溫程序［11］（初始溫度：80 ℃，保持 1 min，以 20 ℃ ／ min 的速率升溫至200 ℃，保持5 min，運(yùn)行12 min）和等溫程序（柱溫：120 ℃，運(yùn)行 10 min）進(jìn)行檢測，考察 BPL 峰的出峰時間和分離度。

1.4.2 流速的選擇 分別采用 1 和 3 mL ／ min 流速進(jìn)行檢測，依據(jù)BPL 峰的分離度和拖尾因子選擇方法的流速。

1.4.3 進(jìn)樣量的選擇 分別進(jìn)樣1 和0.2 μL，進(jìn)行檢測，依據(jù)BPL 峰的分離度和拖尾因子選擇方法的進(jìn)樣量。

1.5 方法的驗(yàn)證

1.5.1 專屬性 取0.101 2 g BPL 對照品，置100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制成1 mg ／ mL 的BPL 對照品溶液；再進(jìn)行 3 倍稀釋，配制成 337 μg ／mL的 BPL 對照品溶液。用 1 mg ／ mL 的 BPL 對照品溶液與疫苗原液按1 ∶1 的比例混合（混合樣品）。將1 mg ／ mL 的BPL 對照品溶液及混合樣品按最佳條件進(jìn)行檢測，確定BPL 峰的保留時間和分離度，兩者BPL 峰的保留時間應(yīng)一致，分離度應(yīng) ＞1.5。同時以乙腈作為空白對照。

1.5.2 重復(fù)性 取 337 μg ／ mL 的 BPL 對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，按最佳條件進(jìn)行檢測，計(jì)算峰面積和保留時間。峰面積和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）應(yīng) ≤ 4.0%。

1.5.3 耐用性 取 337 μg ／ mL 的 BPL 對照品溶液，于不同檢測器溫度（245、250、255 ℃）、不同進(jìn)樣口溫度（175、180、185 ℃）條件下，按最佳條件進(jìn)行檢測，計(jì)算峰面積和保留時間。峰面積和保留時間的 RSD 應(yīng) ≤ 4.0%。

1.5.4 線性范圍 用乙腈配制濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.625、3.125 μg ／ mL 的 BPL 對照品溶液，按最佳條件進(jìn)行檢測，計(jì)算BPL 峰面積。以峰面積為橫坐標(biāo)，BPL 濃度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，獲得線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)（r）應(yīng) ≥0.999。

1.5.5 定量限及檢測限 取 1 mg ／ mL 的 BPL 對照品溶液，用乙腈稀釋100 倍，再進(jìn)行4 倍稀釋，按最佳條件進(jìn)行檢測，將信噪比10 ∶1 的樣品濃度確定為此方法的定量限；再稀釋3 倍，將信噪比3 ∶1 的樣品濃度確定為此方法的檢測限。

1.6 方法的應(yīng)用

1.6.1 疫苗滅活過程中BPL 含量的檢測 取已滅活水解的新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）濃縮液，加入體積比為 1 ∶4 000 的 BPL，分別于 2 ～ 8 ℃放置 0、12、24、36、48 h 取樣，按最佳條件進(jìn)行檢測，根據(jù)峰面積計(jì)算BPL 含量，并繪制含量與時間的變化曲線。

1.6.2 疫苗水解過程中BPL 含量的檢測 取經(jīng)BPL 滅活的的新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）濃縮液，放置37 ℃進(jìn)行水解，每隔30 min 取樣，按最佳條件進(jìn)行檢測，根據(jù)峰面積計(jì)算BPL 含量，并繪制含量與時間的變化曲線。

1.6.3 疫苗原液中BPL 殘留量的檢測 取連續(xù)3批新型冠狀病毒疫苗（Vero 細(xì)胞）原液，與乙腈按1 ∶1的比例混合后，采用最佳條件進(jìn)行檢測，計(jì)算疫苗原液中BPL 的殘留量。

2 結(jié) 果

2.1 方法的優(yōu)化 升溫程序和等溫程序BPL 峰出峰時間分別為5.163 和2.318 min，分離度分別為16.2 和 8.0。1 和 3 mL ／ min 流速檢測的 BPL 峰拖尾因子分別為1.74 和1.34，分離度分別為8.6 和8.2。1 和0.2 μL 進(jìn)樣檢測的BPL 峰拖尾因子分別為1.74和0.79，分離度分別為8.6 和5.8。因此確定該檢測方法的最佳檢測程序?yàn)榈葴爻绦?，流速? mL／min，進(jìn)樣量為 0.2 μL。

2.2 方法的驗(yàn)證

2.2.1 專屬性 337 μg ／mL 的 BPL 對照品溶液的乙腈峰及BPL 峰保留時間分別為1.185 和2.318 min，分離度為7.96?；旌蠘悠返囊译娣搴虰PL 峰的保留時間分別為1.197 和2.328 min，分離度為2.14，且BPL 峰保留時間與BPL 對照品溶液一致。見圖1。表明該方法能特異性檢測新冠原液中的BPL 殘留。

圖1 BPL 的氣相色譜檢測圖譜Fig.1 Gas chromatogram of BPL

2.2.2 重復(fù)性 BPL 對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次后，峰面積和保留時間的RSD 分別為1.3%和0.063%，均≤4.0%，見表1。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果Tab.1 Verification for reproducibility

2.2.3 耐用性 BPL 對照品溶液在不同檢測器溫度及進(jìn)樣口溫度條件下檢測，峰面積和保留時間的RSD 分別為0.4%和0.036%，均 ≤ 4.0%，見表2。表明檢測器溫度及進(jìn)樣口溫度對試驗(yàn)結(jié)果無明顯影響。

表2 耐用性驗(yàn)證結(jié)果Tab.2 Verification for durability

2.2.4 線性范圍 BPL 對照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。BPL 對照品溶液在 3.125 ～ 500 μg ／ mL 濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y = 1.399 1 x - 0.558 6，r 為 0.999 9。

圖2 氣相色譜法檢測BPL 含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for determination of BPL content by gas chromatography

2.2.5 定量限及檢測限 信噪比為10 ∶1 時，獲得方法的定量限為2.530 μg／mL，峰面積為1.795 mAU*s；信噪比為 3 ∶1 時，獲得方法的檢測限為 0.843 μg ／mL，峰面積為0.496 mAU*s。

2.3 方法的應(yīng)用

2.3.1 疫苗滅活過程中BPL 的含量 于2 ～8 ℃放置0 h 時BPL 含量明顯低于實(shí)際加入量，證明BPL極易水解的特性，BPL 的含量隨著時間逐漸降低，水解速度逐漸趨于平緩，水解48 h 后，含量高于定量限，見圖3。表明BPL 加入量可保障病毒在48 h 內(nèi)的持續(xù)滅活。

圖3 滅活過程中BPL 含量的變化趨勢Fig.3 Change trend of BPL content during inactivation

2.3.2 疫苗水解過程中BPL 的含量 BPL 在37 ℃水浴環(huán)境中逐漸水解，30 min 后其含量低于定量限，120 min 后遠(yuǎn)低于檢測限，見圖4。

圖4 水解過程中BPL 含量的變化趨勢Fig.4 Change trend of BPL content during hydrolysis

2.3.3 疫苗原液中BPL 的殘留量 3 批新型冠狀病毒疫苗（Vero 細(xì)胞）原液中均未檢測到BPL 峰，表明原液中BPL 含量遠(yuǎn)低于該方法的檢測限0.843 μg／mL，原液中幾乎無BPL 殘留。

3 討 論

20 世紀(jì)50 年代，BPL 是生產(chǎn)丙烯酸的一種重要的商業(yè)化學(xué)品，也用于外科器械、血漿、組織移植、牛奶、水、培養(yǎng)基和酶的消毒。由于其具有良好的殺孢作用，被用于殺滅細(xì)菌、病原真菌和病毒［12-14］。《中國藥典》三部（2015 版）［15］的凍干人用狂犬病疫苗（Vero 細(xì)胞）制備要求中規(guī)定，對狂犬病病毒濃縮液的滅活按1 ∶4 000 比例加入BPL。武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司在新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero細(xì)胞）前期研發(fā)中設(shè)立了4 個不同的BPL 工作濃度，即 1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000 及 1 ∶8 000，其中 1 ∶1 000 及 1 ∶2 000 在疫苗滅活過程中會引起抗原含量損失，1 ∶4 000 及 1 ∶8 000 對抗原影響較小，考慮到新型冠狀病毒屬于生物安全3 級以上病原微生物，且《中國藥典》三部（2015 版）［15］人用疫苗總論規(guī)定，滅活工藝參數(shù)應(yīng)至少為徹底滅活參數(shù)的2 倍，因此，本公司最終設(shè)定新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）的滅活劑濃度為 1 ∶4 000，2 ～8 ℃條件下滅活時間不少于48 h，確保生產(chǎn)和接種的安全性。

新型冠狀病毒其活毒操作均需在生物安全3級及3 級以上實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，本研究實(shí)驗(yàn)環(huán)境無法直接檢測病毒濃縮液實(shí)際滅活過程中BPL 的含量變化，因此采用模擬滅活的方法間接檢測疫苗滅活及水解過程中BPL 的含量變化，結(jié)果顯示，按1 ∶4 000加入BPL，其含量在整個滅活過程中均高于定量限，于37 ℃水解2 h 后，BPL 含量低于方法的檢測限。濃縮液經(jīng)BPL 兩次滅活、兩步層析純化后所得原液中無法檢測到BPL 峰，表明原液中幾乎無BPL 殘留，符合安全生產(chǎn)需求及疫苗滅活劑殘留標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量要求。

綜上所述，本研究建立的氣相色譜法操作簡單、檢測時間短、效率高、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可滿足疫苗中BPL 殘留的檢測需求。