汪軍梅，張毅強(qiáng)，黃燕，栗學(xué)清，裴晉紅

山西長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西長(zhǎng)治046000

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型之一，每年有100 多萬(wàn)新診斷的乳腺癌病例和502 000 例與乳腺癌有關(guān)的死亡病例［1］。近年，我國(guó)乳腺癌年死亡率呈上升趨勢(shì)，該疾病嚴(yán)重威脅了全球女性的身心健康［2］。因此，對(duì)乳腺癌發(fā)病分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)對(duì)治療該疾病具有重要意義。

高遷移率族（high-mobility group，HMG）盒轉(zhuǎn)錄因子 1（HMG-box transcription factor 1，HBP1）是一個(gè)細(xì)胞調(diào)控基因，屬于HMG 轉(zhuǎn)錄因子家族，具有該家族成員典型的DNA 結(jié)合域，即HMG 盒結(jié)合域［3］。HBP1 基因定位于人類(lèi)7 號(hào)染色體長(zhǎng)臂22 ～31 區(qū)，DNA 總長(zhǎng) 33 510 bp，mRNA 總長(zhǎng) 2 828 bp，含 11 個(gè)外顯子［4］。研究發(fā)現(xiàn)，HBP1 參與抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲等過(guò)程。LEE 等［5］研究表明，HBP1 與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)；DONG 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細(xì)胞U2OS 過(guò)表達(dá)HBP1 后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢，骨肉瘤細(xì)胞的增殖受到抑制。由此可見(jiàn)，HBP1 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

本研究采用生物信息方法分析預(yù)測(cè)乳腺癌中HBP1 基因突變情況，同時(shí)應(yīng)用 Oncomine 及KM plotter 等網(wǎng)上在線工具分析乳腺癌中HBP1 基因表達(dá)量及其與乳腺癌預(yù)后生存期的關(guān)系，并篩選出乳腺癌中與HBP1 相關(guān)的基因，為乳腺癌的早期診斷和靶向治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料 1 756 例乳腺癌患者的1 981 份樣本資料源自MSK 數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 樣本資料的分析 應(yīng)用cBioportal 網(wǎng)站對(duì)1 756例乳腺癌患者的1 981 份樣本的資料進(jìn)行分析，主要包括病例腫瘤亞型、年齡、突變基因數(shù)目等基本信息。

1.3 HBP1基因在乳腺癌中突變的分析 應(yīng)用cBioportal網(wǎng)站提供的在線分析工具分析1 756 例乳腺癌患者的1 981 份樣本中HBP1 基因的突變情況。

1.4 乳腺癌中HBP1 基因表達(dá)情況的分析 應(yīng)用Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)分析HBP1 基因在乳腺癌中的表達(dá)情況。

1.5 HBP1 基因表達(dá)量與生存期相關(guān)性的分析 應(yīng)用KM plotter 在線分析HBP1 基因表達(dá)量與乳腺癌患者生存期的關(guān)系，繪制HBP1 基因表達(dá)的生存曲線，cut off 值設(shè)為median，以評(píng)價(jià)HBP1 基因?qū)膊☆A(yù)后的相關(guān)性。

1.6 HBP1 基因共表達(dá)基因的分析 應(yīng)用Coexpedia（http：／／www.coexpedia.org ／）及Harmonizome（http：／ ／amp.pharm.mssm.edu ／ Harmonizome ／）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得HBP1 基因共表達(dá)基因，并采用韋恩圖取交集，篩選出部分HBP1 基因共表達(dá)基因。

1.7 乳腺癌中與HBP1 基因表達(dá)相關(guān)基因的分析應(yīng)用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析1.6 項(xiàng)篩選出的HBP1 基因共表達(dá)基因在乳腺癌中與HBP1 基因的相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 cBioportal、Oncomine、KM plotter 和GEPIA 等數(shù)據(jù)庫(kù)在線工具軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，HBP1 基因在乳腺癌中表達(dá)水平的組間比較采用t 檢驗(yàn)，HBP1 基因表達(dá)量與生存期的相關(guān)性采用Kaplan-Meier 方法，乳腺癌中與HBP1 基因表達(dá)相關(guān)基因的分析采用直線相關(guān)方法，均以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌樣本資料 1 756 例乳腺癌患者中，患乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管瘤的比例為76.8%，占絕大多數(shù)，見(jiàn)表1；患者年齡以46 ～50 歲最多，達(dá)305 例，占比約16.41%，見(jiàn)圖1；基因同時(shí)突變數(shù) ≤ 2 個(gè)的病例數(shù)最多，達(dá)326 例，其次為基因同時(shí)突變3 個(gè)的病例，為297 例，見(jiàn)圖2。

表1 乳腺癌的分型情況Tab.1 Classification of breast cancer

圖1 1 756 例乳腺癌患者的年齡分布情況Fig.1 Age distribution of 1 756 patients with breast cancer

圖2 1 756 例乳腺癌患者基因突變數(shù)目分布情況Fig.2 Distribution of number of gene muta tions in 1 756 pa-tients with breast cancer

2.2 HBP1 基因在乳腺癌中的突變情況 HBP1 基因在乳腺癌中的整體突變率為0.00%，未見(jiàn)錯(cuò)義突變、短截突變、框內(nèi)突變及其他突變，見(jiàn)圖3。

圖3 HBP1 基因在乳腺癌組織的突變情況分析Fig.3 Analysis of mutations of HBP1 gene in breast cancer tissue

2.3 乳腺癌中HBP1 基因的表達(dá)情況 乳腺癌組織中HBP1 基因表達(dá)水平明顯低于正常組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 16.6，P ＜ 0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 HBP1 基因在乳腺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)水平Fig.4 Expression level of HBP1 in breast cancer tissue samples

2.4 HBP1 基因表達(dá)量與生存期的相關(guān)性 HBP1基因表達(dá)水平與乳腺癌預(yù)后呈正相關(guān)［HR = 0.63（95% CI：0.51 ～ 0.78），P = 2.2 e-05］，見(jiàn)圖5。表明HBP1 基因在乳腺癌中具有抑癌基因功能。

圖5 HBP1 基因表達(dá)水平與乳腺癌患者生存期的相關(guān)性分析Fig.5 Relationship of HBP1 gene epxression level to survival period of patients with breast cancer

2.5 HBP1 基因的共表達(dá)基因 取Coexpedia 數(shù)據(jù)庫(kù)中分值較高的前100 個(gè)HBP1 基因共表達(dá)基因，Harmonizome 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示出254 個(gè)HBP1 基因共表達(dá)基因，其中 BTG1、CREBBP 和 SH3BGRL 共 3 個(gè)基因?yàn)閮蓴?shù)據(jù)庫(kù)共有。

2.6 乳腺癌中與HBP1 基因表達(dá)相關(guān)的基因 乳腺癌中BTG1、CREBBP 和SH3BGRL 3 個(gè)基因均與HBP1存在相關(guān)性，其中HBP1 與BTG1、CREBBP 基因表達(dá)呈正相關(guān)，與SH3BGRL3 基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（R 分別為 0.28、0.63、-0.31，P 均 ＜ 0.01）。見(jiàn)圖6。表明HBP1 基因作為轉(zhuǎn)錄因子有可能調(diào)控這3 個(gè)基因的表達(dá)。

圖6 乳腺癌中 HBP1 與 BTG1（A）、CREBBP（B）、SH3BGRL（C）基因的相關(guān)性Fig.6 Relationship of HBP1 to and BTG1（A），CREBBP（B）and SH3BGRL3（C）genes in breast cancer

3 討 論

乳腺癌是女性患者常見(jiàn)惡性腫瘤，隨著早期診斷水平的提高，確診率迅速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，疾病負(fù)擔(dān)日益加重。因此，對(duì)乳腺癌發(fā)病分子機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)仍是研究的熱點(diǎn)。

HBP1 是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)直接結(jié)合DNA、輔因子募集、染色質(zhì)重塑或中和其他轉(zhuǎn)錄因子，從而激活或抑制基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、衰老和凋亡中起重要作用［7-8］。對(duì)HBP1 的研究目前多集中在其下游靶基因，其活化的上游信號(hào)分子尚未明確。現(xiàn)已知HBP1 靶基因包括 Nmyc、c-myc、cyclin D1、MIF、p16（Ink4a）、p47phox 和 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 1（DNMT1）等［9］。研究發(fā)現(xiàn)，HBP1 可通過(guò)直接結(jié)合其靶基因或競(jìng)爭(zhēng)性抑制其他轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活作用的方式抑制目的基因的表達(dá)，包括N-MYC、MIF 和 EZH2 等［10-11］。另外，HBP1 也可轉(zhuǎn)錄激活 P16、P21 和髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等基因［12］。有報(bào)道表明，目前普遍認(rèn)為HBP1主要是作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用。HBP1 可抑制不同類(lèi)型細(xì)胞和器官的腫瘤發(fā)生，如宮頸癌、肝癌和口腔癌等［12-14］。上述研究表明，HBP1 可調(diào)控多種靶基因，從而影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

本研究通過(guò)在線工具對(duì)HBP1 進(jìn)行生物信息學(xué)研究，登錄cBioportal 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)1 756 例乳腺癌患者基因突變情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，基因同時(shí)突變數(shù)量 ≤ 2 個(gè)基因的病例最多，有326 例，其次為同時(shí)突變3 ～4 個(gè)基因的病例，為297 例。HBP1 基因的突變?cè)诮?rùn)性乳腺癌中被提出，但未在大規(guī)模的乳腺癌測(cè)序研究中得到證實(shí)［3］。推測(cè)HBP1 突變可能與樣本來(lái)源的人種、癌腫亞型等有關(guān)，也許還有其他未知原因。HBP1 突變情況及其可能的作用機(jī)制，對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的闡明及疾病預(yù)后均有較大的臨床意義。本研究結(jié)果表明，在乳腺癌中HBP1基因整體突變率為0.00%，目前這方面的研究還較少，需更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

登錄Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析HBP1 基因在乳腺癌組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，HBP1在乳腺癌組織中呈低表達(dá)（P ＜0.01）。另外，應(yīng)用KM plotter 網(wǎng)上分析工具分析了HBP1 表達(dá)水平與乳腺癌生存期的關(guān)系，結(jié)果表明，其表達(dá)水平與乳腺癌預(yù)后呈明顯正相關(guān)性（P ＜0.001），這些均提示HBP1 在乳腺癌中可能主要起抑癌基因功能。為進(jìn)一步探明乳腺癌中與HBP1 相關(guān)的基因，應(yīng)用Coexpedia 及 Harmonizome 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得 HBP1 共表達(dá)基因，為增加預(yù)測(cè)的可信度，將兩數(shù)據(jù)庫(kù)所篩選出的共表達(dá)基因利用韋恩圖取交集，結(jié)果顯示，BTG1、CREBBP 和SH3BGRL3 共3 個(gè)基因?yàn)閮蓴?shù)據(jù)庫(kù)共有；GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 BTG1、CREBBP 和 SH3BGRL3與HBP1 的相關(guān)性，結(jié)果顯示，乳腺癌中3 個(gè)基因均與HBP1 存在相關(guān)性，其中HBP1 與BTG1、CREBBP表達(dá)量呈正相關(guān)（P ＜ 0.05），與 CREBBP 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P ＜ 0.05）。BTG1、CREBBP 和 SH3BGRL3 這3 個(gè)基因與腫瘤的發(fā)生均相關(guān)［15-17］。HBP1 作為轉(zhuǎn)錄因子有可能通過(guò)調(diào)控這3 個(gè)基因的表達(dá)，從而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，但HBP1 對(duì)這3 個(gè)基因的調(diào)控及作用機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)了HBP1 在乳腺癌中的突變情況及可能的生物學(xué)功能；同時(shí)發(fā)現(xiàn)了與 HBP1 共同發(fā)揮生物學(xué)功能的相關(guān)基因 BTG1、CREBBP 和 SH3BGRL3，為乳腺癌的早期分子診斷，靶向治療及預(yù)后判斷奠定了基礎(chǔ)。