李淑萍，陳韻，崔天嬌，王曉華，李金紅，鄭智華

中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東深圳518107

巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的C 型凝集素（macrophage inducible C-type lectin，Mincle）是一種Ⅱ型跨膜的 C 型凝集素受體，在天然免疫中起重要作用［1］。Mincle可通過胞外的碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate recognition domain，CRD）和膽固醇-蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)識別自身受損細(xì)胞及外源微生物產(chǎn)生的脂類和糖脂類，并介導(dǎo)下游信號通路促進(jìn)細(xì)胞釋放炎癥因子［2］。由于Mincle 在識別索狀因子等含有海藻糖基的脂類和膽固醇過程中起關(guān)鍵作用，其在對抗相關(guān)微生物感染的機(jī)理和自身免疫疾病中的作用研究已成為研究熱點(diǎn)。

Mincle 主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞中，也表達(dá)于中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和部分B 細(xì)胞等免疫細(xì)胞中［3-5］。與配體結(jié)合后，Mincle 可通過FcRγ 的免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）向胞內(nèi)傳遞激活信號［6］，使Syk 和 Card9-Bcl10-MALT1 等信號通路蛋白活化［7］，最終激活 NF-κB，使細(xì)胞分泌 TNF、IL-6、G-CSF、IL-11等炎癥細(xì)胞因子和CXCL1、CXCL2 等趨化因子來介導(dǎo)對抗微生物感染的炎癥反應(yīng)［1］。由于不同類型的外周血細(xì)胞在免疫方面的功能不同，其Mincle 的表達(dá)量也可能有所差異，本研究分析了Mincle 在不同類型外周血細(xì)胞中的表達(dá)量，為探討其在這些細(xì)胞介導(dǎo)的天然免疫功能中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 人外周血細(xì)胞樣本 選取15 名體檢就診的人外周抗凝血1 mL。

1.2 主要試劑及儀器 APC 標(biāo)記的抗人CD11b 抗體購自美國BD Biosciences 公司；Alexa 488 標(biāo)記的抗人Mincle 抗體購自美國Santa Cruz 公司；Alexa 488標(biāo)記的抗IgG Isotype Control 兔單抗購自美國Cell SignalingTechnology 公司；胎牛血清（FBS）購自 Thermo Scientific 公司（原產(chǎn)地澳大利亞）；流式細(xì)胞儀Cyto Flex XL 購自美國Beckman Coulter 公司，為中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院科研中心公共設(shè)備。

1.3 外周血細(xì)胞的處理 取抗凝管中全血1 mL 于15 mL 離心管中，加入 9 mL 紅細(xì)胞裂解液（0.16 mol／L NH4Cl，10 mmol ／L KHCO3，0.5 mmol ／ L EDTA），4 ℃放置 5 min，300 × g 離心 5 min，棄上清，重復(fù) 3 次，最后用含3% FBS 的PBS 重懸細(xì)胞。

1.4 Mincle 在不同類型外周血細(xì)胞中表達(dá)的檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。按照產(chǎn)品說明，在重懸的細(xì)胞中加入適量抗人CD11b-APC 抗體和抗人Mincle-Alexa 488抗體，4 ℃避光孵育 1 h；用 1 mL 含 3%FBS 的 PBS 洗滌3 次后，上流式細(xì)胞儀檢測。使用FlowJo 10 軟件（FLOWJO，LLC）對流式細(xì)胞結(jié)果進(jìn)行分析并做圖。將Alexa 488 標(biāo)記的同型對照抗人兔單抗和抗人Alexa488-CLEC4E（Mincle）抗體分別染色同一細(xì)胞，染色的同一細(xì)胞的MFI 減去熒光色素標(biāo)記細(xì)胞的MFI，以確定 MFI 的特異性增加（△MFI）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25 軟件進(jìn)行Mincle 表達(dá)量和臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析，采用雙變量線性相關(guān)性分析方法，通過斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)（Spearman’r）評價(jià)兩個(gè)統(tǒng)計(jì)變量的相關(guān)性。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Mincle 在CD11b 陽性和陰性細(xì)胞中的表達(dá) 通過前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）設(shè)門選擇白細(xì)胞群，再進(jìn)一步通過CD11b-APC 熒光信號強(qiáng)度設(shè)門選擇CD11b 陽性和陰性的白細(xì)胞群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Mincle 表達(dá)于CD11b 陽性的髓系白細(xì)胞中，但不表達(dá)于CD11b 陰性的白細(xì)胞中，見圖1。

2.2 Mincle 在單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的表達(dá) 通過CD11b-APC 和SSC 將外周血白細(xì)胞分為單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞3 個(gè)細(xì)胞群，發(fā)現(xiàn)Mincle在單核細(xì)胞中表達(dá)最高，在粒細(xì)胞中其次，在淋巴細(xì)胞中無表達(dá)，見圖2。進(jìn)一步比較來自15 人3 個(gè)細(xì)胞群的Mincle 表達(dá)量，得到相同的結(jié)果，且兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.000 1），見圖3。

2.3 Mince 在粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)量的臨床相關(guān)性 將Mincle 在粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中的表達(dá)量分別與部分臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Mincle 在單核細(xì)胞中的表達(dá)量與紅細(xì)胞沉降率呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.709（P = 0.032）。見表1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分析人外周血中Mincle 在CD11b 陽性和陰性細(xì)胞群中的表達(dá)Fig.1 Flow cytometry of expression of Mincle in CD11b-positive and -negative cells in human peripheral blood

表1 部分臨床數(shù)據(jù)與Mincle 在粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)量的相關(guān)性Tab.1 Correlation of partial clinical data to expression levels of Mincle in granulocytes，lymphocytes and moncytes

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析Mincle 在單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Flow cytometry of expression of Mincle in monocytes，granulocytes and lymphocytes

圖3 Mincle 在3 個(gè)細(xì)胞群中的表達(dá)Fig.3 Expression of Mincle in three cell groups

3 討 論

本研究探究了Mincle 在各類人外周血細(xì)胞中的表達(dá)分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mincle 表達(dá)于CD11b 陽性的髓系細(xì)胞中，其中單核細(xì)胞中的表達(dá)量高于粒細(xì)胞，在淋巴細(xì)胞中則無表達(dá)。

Mincle 是凝集素受體家族的一員，其家族成員可識別廣泛的各類自身和外源配體［8］，其中Mincle的獨(dú)特作用是識別脂類和糖脂類，還包括SAP130等自身抗原，因此，Mincle 在對抗外源微生物感染和自身免疫疾病中均起著重要作用［2］。外周血中的單核細(xì)胞和粒細(xì)胞為人體天然免疫的組成部分，是人體對抗外源微生物的防御屏障［9-10］，Mincle 在這兩類細(xì)胞中高表達(dá)，表明其為它們介導(dǎo)的天然免疫過程中的重要參與者。Mincle 在單核細(xì)胞中的表達(dá)量高于粒細(xì)胞，這可能與其在巨噬細(xì)胞中的重要作用相關(guān)。巨噬細(xì)胞由外周血中的單核細(xì)胞遷移進(jìn)入組織分化形成，Mincle 與配體結(jié)合后，可促使巨噬細(xì)胞釋放大量炎癥因子來對抗微生物感染［3］。Mincle在單核細(xì)胞中的高表達(dá)很可能表明其在單核細(xì)胞中也有相似的功能。有研究發(fā)現(xiàn)［11］，Mincle 在部分B細(xì)胞亞群中表達(dá)，而本研究并未發(fā)現(xiàn)Mincle 在淋巴細(xì)胞中表達(dá)，這可能與該類B 細(xì)胞亞群的數(shù)量和激活狀態(tài)有關(guān)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在正常人外周血單核細(xì)胞中，Mincle 的表達(dá)與紅細(xì)胞沉降率呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合紅細(xì)胞沉降率的臨床意義和受試者的平均紅細(xì)胞沉降率水平，推測正常人群中外周血單核細(xì)胞的Mincle 表達(dá)量升高可能與正常人群中體內(nèi)的低水平炎癥反應(yīng)相關(guān)。最新關(guān)于Mincle 在炎癥方面的研究仍集中于感染免疫［12-13］，這也與Mincle 分子本身的定義和來源相符，但其在非感染性炎癥和無菌性炎癥領(lǐng)域的具體作用機(jī)制還有待商榷，需進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。

綜上所述，本研究分析了Mincle 在外周血細(xì)胞中的分布，為探討其在各類細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。