嚴(yán)江渝，張策

山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030001

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一種死亡率極高、預(yù)后不良的高度侵襲性的惡性腫瘤，總體5 年存活率仍然低于8%，中位生存期僅5 ～6 個(gè)月［1］。據(jù)估計(jì)，至2030 年，PC 將成為美國癌癥相關(guān)死亡的第二大常見原因［2］。由于缺乏早期篩查技術(shù)，大多數(shù)PC 患者被診斷時(shí)即為晚期，不再適合手術(shù)切除［3］。因此，在PC 中急需發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。

離子通道是癌癥研究中的一個(gè)新興領(lǐng)域，同時(shí)被認(rèn)為是潛在的治療靶點(diǎn)。在過去的幾十年中，離子通道的失調(diào)和／ 或功能障礙已被報(bào)道存在于不同癌癥疾病中［4-5］。離子通道參與許多重要的病理過程，如代謝重組［6］、增殖［7］、細(xì)胞凋亡［8］、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［9］、遷移和侵襲［10-11］。

由細(xì)胞內(nèi)Ca2+和膜去極化激活的K+通道BK 通道（KCNMA1，KCa1.1，MaxiK）在許多細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)［12］。除了眾所周知的參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性和血管張力功能［13］，還有研究表明，BK 通道也與許多類型的癌癥的發(fā)展和進(jìn)展相關(guān)，包括乳腺癌［14］、胸膜間皮瘤［15］和前列腺癌［16］等。

據(jù)報(bào)道，KCNMA1 存在于正常胰腺的導(dǎo)管上皮中，并在調(diào)節(jié)HCO3-分泌中起關(guān)鍵作用［16-17］。但KCNMA1是否可在PC 中表達(dá)及其作用機(jī)制尚不清楚。本文在PC 細(xì)胞系中表達(dá)KCNMA1，并探討其在增殖、凋亡、遷移和侵襲中作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 文中所用細(xì)胞系均由上海腫瘤研究所張志剛實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM 和RPMI 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；LipofectamineTMRNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑及TRIzol RNA 分離試劑購自美國Invitrogen 公司；Prime ScriptTMRT Master Mix 購自日本TaKaRa 公司；磷酸酶抑制劑購自美國Bimake 公司；BCA 蛋白質(zhì)測定試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；gelRed 購自美國Biotium 公司；Anti-Bcl-2（ab32124）、anti-Bax（ab32-503）、anti-Caspase-3（ab32351）、anti-KCNMA1（ab3586）及 anti-PARP1 抗體（ab32064）購自美國 Abcam 公司；anti-Actin 抗體（R1102-1）和山羊抗兔 IgG 辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（HA1023）購自杭州HuaBio 公司；Annexin V-FITC ／ PI 凋亡測定試劑盒、2 × Taq plus PCR MasterMix 購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；CCK-8 試劑購自日本Dojindo 公司；Transwell 購自美國 Corning 公司；T100 TM 熱循環(huán)儀系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司；增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)購自美國GE 公司；Matrigel 及流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及基因沉默 Patu-8988T、MiaPaCa-2、PANC-1、Capan-1 細(xì)胞在含 10%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基中于 37 ℃和 5%CO2條件下培養(yǎng)，AsPC-1、CFPAC-1、BxPC-3 細(xì)胞在含10% FBS 的RPMI 培養(yǎng)基中37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)LipofectamineTM說明書進(jìn)行非靶向?qū)φ?′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′和靶向 KCNMA1 5′-CUGGCAGAGUCCUGGUUGUTT-3′的 siRNA 轉(zhuǎn)染。siRNA 由 Gene Pharma（上海）合成。轉(zhuǎn)染48 h 后收獲細(xì)胞并用于以下試驗(yàn)，對照（NC）組為轉(zhuǎn)染非同源 siRNA 組，干擾（si-KCNMA1）組為轉(zhuǎn)染siRNA 靶向敲除KCNMA1 組。所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.4 KCNMA1 在PC 細(xì)胞系上表達(dá)的檢測 采用RT-PCR 法。使用TRIzol RNA 分離試劑從細(xì)胞中提取總RNA，按PrimeScriptTMRT Master Mix 說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，利用2 × Taq plus PCR MasterMix 和T100 TM 熱循環(huán)儀系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。Actin-F 引物序列：5′-GTACGCCAACACAGTGCTG-3′，Actin-R 引物序列：5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′；KCNMA1-F 引物序列：5′-TCTTTGCTCTCAGCATGGTG-3′，KCNMA1-R 引物序列：5′-CCGCAAGCCGAAGTAGAGAAG-3′。引物由賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，使用gelRed 染色，NIH Image 1.60軟件分析結(jié)果。

1.5 沉默KCNMA1 基因?qū)C 細(xì)胞增殖影響的檢測 采用CCK-8 法。具體操作按試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染siRNA 48 h 后，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)PC 細(xì)胞，按5 ×103個(gè) ／ 孔接種至96 孔板中并在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別于 0、24、48 h 加入 CCK-8，10 μL ／ 孔，37 ℃溫育2 h，450 nm 處檢測吸光度，繪制生長曲線。

1.6 沉默KCNMA1 基因?qū)C 細(xì)胞凋亡影響的檢測 采用 Annexin V-FITC ／ PI 雙染法。細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 48 h 后，棄掉培養(yǎng)基，PBS 洗滌 2 次，用不含EDTA 的胰酶消化，加入1 mL PBS 吹起細(xì)胞，收集液體，700 × g 離心 5 min，預(yù)冷 PBS 洗滌 2 次，400 μL 1 × Banding buffer 懸浮細(xì)胞，濃度約 1 × 106個(gè) ／ mL；在細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后于2 ～ 8 ℃避光孵育 15 min；加入 10 μL PI，混勻后于2 ～8 ℃避光孵育5 min；上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.7 沉默KCNMA1 基因?qū)C 細(xì)胞遷移及侵襲影響的檢測 轉(zhuǎn)染siRNA 48 h 后收集細(xì)胞（5×105個(gè)），重懸于無血清培養(yǎng)基中，加至覆蓋有50 μL Matrige的Transwell 上室，下室加入含10% FBS 的培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘物，孵育24 h；用棉絨刮擦去除上室細(xì)胞，4% PFA 固定并經(jīng)結(jié)晶紫染色，通過計(jì)數(shù)染色的細(xì)胞確定侵入能力。遷移測定除上室內(nèi)不用Matrigel覆蓋，其他方法相同。

1.8 Western blot 分析 轉(zhuǎn)染siRNA 48 h 后收集細(xì)胞，用加有苯基甲磺酰氟（PMSF）和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解緩沖液（RIPA）裂解細(xì)胞30 min；BCA 蛋白質(zhì)測定試劑測定蛋白質(zhì)濃度。通過垂直電泳分離蛋白，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫5%BSA（w ／ v）封閉 1 h；將膜與一抗于 4 ℃溫育過夜；PBST 洗滌，將膜與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗于室溫溫育1 h；PBST 洗滌，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物。

2 結(jié) 果

2.1 KCNMA1 在PC 細(xì)胞系上的表達(dá) PCR 結(jié)果顯示，KCNMA1 在 MiaPaCa-2 和 PANC-1 細(xì)胞上的表達(dá)水平明顯高于其他細(xì)胞系，見圖1，因此選取MiaPaCa-2 和PANC-1 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。Western blot 分析顯示，轉(zhuǎn)染siRNA 48 h 后，能顯著減少KCNMA1 蛋白在MiaPaCa-2 和PANC-1 細(xì)胞上的表達(dá)，見圖2。

圖1 KCNMA1 在PC 細(xì)胞系上表達(dá)的RT-PCR 檢測Fig.1 Determination of expression of KCNMA1 in PC cell lines by RT-PCR

2.2 沉默KCNMA1 基因?qū)C 細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果顯示，與NC 組相比，從接種轉(zhuǎn)染siRNA 的MiaPaCa-2 和 PANC-1 細(xì)胞后 24 h 開始，各 si-KCNMA1 組 A450即明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（MiaPaCa-2 細(xì)胞中 0、24、48 h t 值分別為 0.854、0.031 和 0.000，PANC-1 細(xì)胞中 0、24、48 h t 值分別為 0.963、0.024和 0.008，P 均 ＜ 0.05），見圖3，表明在 MiaPaCa-2和PANC-1 細(xì)胞中降低KCNMA1 的表達(dá)均可使細(xì)胞活力降低，抑制增殖。

圖2 沉默KCNMA1 對其在PC 細(xì)胞系上表達(dá)影響的Western blot 分析Fig.2 Analysis of effect of silencing KCNMA1 on expression of KCNMA1 in PC cell lines by Western blot

圖3 沉默 KCNMA1 基因?qū)?MiaPaCa-2（A）和 PANC-1細(xì)胞（B）增殖的影響Fig.3 Effect of KCNMA1 on proliferation of MiaPaCa-2（A）and PANC-1（B）cells

2.3 沉默KCNMA1 基因?qū)C 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在MiaPaCa-2 和PANC-1 細(xì)胞系中下調(diào)KCNMA1 后，凋亡比例分別從8.65%和9.99%增加至12.72%和25.1%，見圖4；Western blot 分析顯示，與 NC 組相比，si-KCNMA1 組凋亡相關(guān)蛋白 BAX、Cleaved-PARP1、Actived-Caspase-3 在MiaPaCa-2 和 PANC-1 細(xì)胞上的表達(dá)增加，BCL-2 在MiaPaCa-2 細(xì)胞上的表達(dá)減少，但在PANC-1 細(xì)胞上的表達(dá)增加，見圖5，與流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果一致。表明沉默KCNMA1 基因誘導(dǎo)了PC 細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。

圖4 沉默KCNMA1 基因?qū)C 細(xì)胞凋亡影響的流式細(xì)胞術(shù)檢測Fig.4 Flow cytometry of effect of silencing KCNMA1 gene on apoptosis of PC cells

圖5 沉默KCNMA1 基因?qū)C 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響的Western blot 分析Fig.5 Analysis of effect of silencing KCNMA1 gene on expression of proteins associated with apoptosis of PC cells by Western blot

2.4 沉默KCNMA1 基因?qū)C 細(xì)胞遷移及侵襲的影響 結(jié)果顯示，與NC 組相比，通過下調(diào)KCNMA1，MiaPaCa-2 和PANC-1 細(xì)胞的遷移明顯減弱，細(xì)胞數(shù)分別從（183.7 ± 4.4）和(186.7 ± 8.2）個(gè)減少至（103.8 ± 10.6）和（117 ± 12.2）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 均為 0.000，P 均 ＜ 0.01），見圖6；在 MiaPaCa-2 和PANC-1 細(xì)胞的侵襲表型上觀察到相同的結(jié)果，細(xì)胞數(shù)分別從（118.4 ± 13.3）和（192.1 ± 16.0）個(gè)減少至（63 ± 5.8）和（116.8 ± 9.8）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 均為 0.000，P 均 ＜ 0.01），見圖7。表明沉默KCNMA1 抑制了PC 細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

圖6 沉默KCNMA1 基因?qū)C 細(xì)胞遷移的影響Fig.6 Effect of silencing KCNMA1 gene on migration of PC cells

圖7 沉默KCNMA1 基因?qū)C 細(xì)胞侵襲的影響Fig.7 Effect of silencing KCNMA1 gene on invasion of PC cells

3 討 論

根據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)的數(shù)據(jù)，2018 年有超過170萬新病例被診斷出來［1］。至目前為止，PC 作為消化道惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、早期轉(zhuǎn)移、局部腫瘤侵襲和化療耐藥性等特點(diǎn)。越來越多的證據(jù)表明，離子通道不僅可以調(diào)節(jié)可興奮細(xì)胞中的離子穩(wěn)態(tài)和電信號(hào)，還可以調(diào)節(jié)多種類型癌細(xì)胞中的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及分化［5，17］。因此，離子通道很可能成為癌癥的潛在治療靶點(diǎn)。

有報(bào)道顯示，KCNMA1 在許多癌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用［5，18］；BLOCH 等［16］報(bào)道，KCNMA1 基因擴(kuò)增可促進(jìn)前列腺癌中腫瘤細(xì)胞的增殖；CAMBIEN等［19］發(fā)現(xiàn)，敲除 BKα 促進(jìn)了骨肉瘤的發(fā)展；EDALAT等［20］發(fā)現(xiàn)，BK 通道阻斷抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的輻射誘導(dǎo)的遷移 ／ 腦浸潤；KHAITAN 等［14］報(bào)道，KCNMA1 在乳腺癌中的表達(dá)與腦轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究首次報(bào)道KCNMA1 可表達(dá)于PC 細(xì)胞MiaPaCa-2 和PANC-1 中。

腫瘤細(xì)胞增殖及抗凋亡活性均較正常細(xì)胞明顯升高，使得惡性腫瘤能夠無限增殖［21］；在癌癥背景下，沉默KV9.3 抑制結(jié)腸癌和胃癌細(xì)胞的增殖［22］；HERG 鉀通道在急性髓性白血病中組成性表達(dá)，并調(diào)節(jié)白血病造血祖細(xì)胞的細(xì)胞增殖［23］；阻斷Nav1.5 通道可減少卵巢癌細(xì)胞的遷移及增殖［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，KCNMA1 具有潛在的調(diào)節(jié)增殖及抗細(xì)胞凋亡作用，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，沉默KCNMA1 誘導(dǎo)了PC 細(xì)胞凋亡，同時(shí)運(yùn)用Western blot 法檢測了凋亡相關(guān)蛋白 BAX、BCL-2、Cleaved-PARP1、Actived-Caspase-3 的表達(dá)，與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致。表明KCNMA1 在MiaPaCa-2 和PANC-1 兩個(gè)細(xì)胞系中對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)具有不同的作用，下調(diào)KCNMA1引起B(yǎng)CL-2 在MiaPaCa-2 上表達(dá)減少而在PANC-1上表達(dá)增加。

癌癥轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致超過90%人類癌癥死亡的根本原因［25］。轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)是一個(gè)多步驟的過程，作為第一步，細(xì)胞遷移在轉(zhuǎn)移中起著不可分割的作用。細(xì)胞遷移的特點(diǎn)是極化細(xì)胞和分子過程，促進(jìn)前緣突出（局部體積增大）和后緣收縮（局部體積減?。?，離子通道在遷移過程中起到關(guān)鍵作用［18］。在促進(jìn)細(xì)胞遷移中對離子通道活性的依賴性已經(jīng)被反復(fù)報(bào)道。如BK 通道的沉默或藥物抑制會(huì)損害膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移［26］；KCa3.1 通道參與體內(nèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的浸潤行為［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，KCNMA1 參與 PC 細(xì)胞的遷移及侵襲，沉默KCNMA1 抑制了PC 細(xì)胞遷移及侵襲的能力。

綜上所述，在PC 細(xì)胞中沉默KCNMA1 能抑制癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。KCNMA1可能為PC 的治療提供新的靶點(diǎn)。