★符小聰 張濤 賴冬萍 丁明健（.江門市五邑中醫(yī)院脾胃病科 廣東 江門 59000；.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院消化科 南寧 5000；.廣西中醫(yī)藥大學 南寧 5000）

反流性食管炎（Reflux Esophagitis, RE）是一種常見的臨床慢性炎癥性疾病，其發(fā)生的主要原因是胃液中含有的胃酸、膽鹽及其他有害物質反流進入食管，致使食管黏膜損傷［1］。據相關數據統(tǒng)計顯示，RE在全球范圍內的發(fā)病率高達40 %［2］，其在亞洲的患病率低于歐洲和美洲，但近年來在亞洲有明顯上升趨勢［3］。目前，臨床上通常使用質子泵抑制劑、抗返流藥物、胃動力藥物和抗抑郁藥物來治療RE。質子泵抑制劑是首選藥物，其在抑制胃酸分泌和緩解RE患者疼痛方面是最有效的，但是質子泵抑制劑不能控制RE的關鍵致病因素，也不能完全治愈RE［4］。并且，長期使用質子泵抑制劑會導致嚴重的并發(fā)癥［5］。

現(xiàn)階段，一些中藥方已被用于治療RE，這些中藥方在緩解癥狀、提高治愈率、減少復發(fā)及不良反應方面顯示出明顯優(yōu)勢［6］。旋覆代赭湯出自東漢張仲景《傷寒論》，由旋覆花、人參、生姜、代赭石、甘草、半夏、大棗七味中草藥組成。它對改善患者胃、食管黏膜炎癥和臨床癥狀，提高適應病治療的有效率方面均有一定的作用［7］。此外，相關研究顯示，旋覆代赭湯無顯著毒副作用，在臨床治療RE患者中沒有引起明顯的不良反應，但其發(fā)揮治療RE的藥理作用機制仍有待闡明。于是，本研究基于大數據庫挖掘和網絡藥理學的方法，旨在探討旋覆代赭湯對RE的治療作用機制，重點揭示其可能作用的關鍵基因和介導的信號通路。本研究將有助于促進旋覆代赭湯的臨床應用和新藥研發(fā)。

1 方法

1.1 反流性食管炎相關靶點的篩選 為了收集RE患者的差異表達基因（Differentially Expressed Genes，DEGs)數據，在Gene Expression Omnibus（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）數據庫中挖掘了mRNA高通量RNA測序和微陣列圖譜。mRNA表達數據采用log2算法進行歸一化和變換，用Fold change（FC）法檢測RE患者組和正常組mRNAs的差異表達。如果｜logFC｜＞1且PValue＜0.05，則將mRNA標記為DEGs。同時利用R語言繪制DEGs火山圖。

1.2 旋覆代赭湯有效化合物及對應靶點的篩選 利用TCMSP平臺（中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺，http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索旋覆代赭湯中旋覆花、人參、生姜、代赭石、甘草、半夏、大棗七味藥的主要化學成分，以ADME性質［8］：口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18為依據篩選可能入血的有效成分，并進行整理。通過DrugBank數據庫篩選出化合物對應的靶點，進行整理并刪除重復項。

1.3 “化合物-交集靶點”網絡 利用Perl語言獲得RE差異表達基因與旋覆代赭湯對應靶點基因的交集靶點。將旋覆代赭湯的有效化合物與其對應交集靶點數據導入Cytoscape 3.7.1軟件（http://www.cytoscape.org/）構建“化合物-交集靶點”網絡圖并進行拓撲分析。

1.4 PPI網絡構建與功能模塊分析 將交集靶點導入STRING11.0數據庫(https://string-db.org)進行分析得到蛋白互作網絡，再將蛋白互作信息導入Cytoscape3.7.1軟件進行可視化及蛋白相互作用分析。利用MCODE插件對網絡進行聚類，以篩選出密集連接的功能模塊，利用Cytohubba插件篩選核心關鍵基因（Hub gene）；再分別利用David在線分析平臺和ClueGO、CluePedia插件對所篩選的功能模塊及Hub基因進行生物學功能注釋和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

1.5 Hub基因-KEGG關系網絡圖的構建 將得到旋覆代赭湯作用于RE的主要通路與核心Hub基因文件導入Cytoscape3.7.1軟件構建“Hub基因-KEGG”關系網絡圖并進行分析。

2 結果

2.1 RE差異表達基因的確定 從GEO數據庫下載符合標準的GSE68698數據集，并利用R軟件包“l(fā)imma”對其進行分析。GSE68698數據集基于GPL6480平臺獲得，包含7例正常樣本和16例RE患者樣本。根據FC分析（篩選條件｜logFC｜＞1且adj.PValue＜ 0.05）共檢測到186個DEGs，其中表達上調的基因有100個，表達下調的基因有86個（圖1）。

圖1 GSE68698差異表達基因火山圖

2.2 旋覆代赭湯的有效化合物收集及靶點預測 在TCMSP平臺以旋覆花、人參、生姜、代赭石、甘草、半夏、大棗為關鍵詞，共搜索到1037個相關化合物。根據設定的篩選條件，篩得旋覆花有效化合物19個、人參有效化合物22個、生姜有效化合物5個、甘草有效化合物92個、半夏有效化合物13個、大棗有效化合物29個，共180個化合物，去重后共得到165個有效化合物成分。應用DrugBank數據庫收集并篩選這165個有效化合物對應的靶點，整理全部靶點并刪除重復項。其中代赭石為礦物質成分氧化鐵（Fe2O3），在現(xiàn)有數據庫中未找到相對應的化學成分及對應靶點。

2.3 “化合物-交集靶點”網絡圖的構建及拓撲分析 應用Perl語言合并獲得RE差異表達基因與旋覆代赭湯對應靶點的交集靶點共71個，與交集靶點相互作用的有效化合物115個。將這115個有效化合物與交集靶點數據導入Cytoscape3.7.1軟件構建“化合物-交集靶點”網絡（圖2）。該網絡圖由186個節(jié)點（115個化合物節(jié)點和71個靶點節(jié)點）和576條邊組成，其中三角形代表靶點、橢圓形代表化合物，且紅色橢圓形化合物節(jié)點表示旋覆代赭湯中7味中藥的共同有效化合物。應用Network Analysis插件進一步進行拓撲學分析，根據網絡節(jié)點的Degree和Betweenness Centrality大小篩選出該網絡中的關鍵化合物（木犀草素、槲皮素、黃芩素、β-胡蘿卜素、豆甾醇、千金藤堿、山奈酚、β-谷甾醇、人參皂苷RH2、柚皮素等）及核心 靶點（AKT1、JUN、EGFR、VEGFA、CCNA2、PPARG、CASP3、MAPK1、MMP1等），認為這些化合物及靶點在整個網絡中起到橋梁作用。

圖2 有效化合物-交集靶點網絡圖

2.4 旋覆代赭湯治療反流性食管炎作用靶點的PPI網絡構建及MCODE功能模塊分析 將71個交集靶點導入STRING數據庫，設置置信度大于0.400，并剔除孤立的靶點蛋白，獲得蛋白互作信息，利用Cytoscape3.7.1軟件進行分析，得到圖3A。該網絡由71個節(jié)點和1176邊組成，經網絡拓撲學分析可知，節(jié)點平均Degree為33.13，大于平均Degree的節(jié)點有34個；節(jié)點平均Betweenness Centrality為0.0080，大于平均Betweenness Centrality的節(jié)點有24個。為了篩選重要模塊，利用MCODE插件對網絡進行聚類，MCODE可用于識別PPI網絡中最密集和最重要的功能模塊。設置篩選標準：Degree Cutoff=2、Node Score Cutoff=0.2、Max.Depth=100、以及K-Core=2，運行后獲得最重要功能模塊（圖3C），認為該模塊涉及的基因在PPI網絡中起到關鍵功能調控作用。

接著使用David軟件對該最重要模塊中涉及的基因進行功能分析，GO分析結果顯示，在血管生成、細胞增殖、凋亡、蛋白質磷酸化、MAPK級聯(lián)反應、缺氧和脂多糖介導的信號轉導等生物學過程中，重要模塊基因富集顯著（圖4A）。重要模塊基因細胞成分的變化主要集中在蛋白質復合物表面、細胞質、胞外間隙、胞外區(qū)和細胞核中（圖4B）。重要模塊基因分子功能的變化主要集中在蛋白激酶結合、轉錄因子結合、蛋白磷酸酶結合、蛋白質結合和泛素蛋白連接酶結合上（圖4C）。KEGG通路分析表明，重要模塊基因主要富集在癌癥途徑、癌癥蛋白多糖途徑、PI3K-Akt信號通路、灶性粘連、MAPK信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路中（圖4D）。

圖3 交集靶點蛋白質-蛋白質相互作用分析及MCODE功能模塊

圖4 MCODE功能模塊基因GO及KEGG分析

2.5 旋覆代赭湯作用于RE的Hub基因選擇 利用Cytohubba插件的六種不同算法篩選Hub基因，每種算法均篩選出Top10的Hub基因，如圖5所示。將六種算法獲得的Hub基因取交集，得到最終的核心Hub基因7個： AKT1、EGFR、JUN、VEGFA、MAPK3、ALB和STAT3，并列舉了這些核心Hub基因的名稱、縮寫及功能（表1）。同時應用ClueGO和CluePedia插件對核心Hub基因進行生物學功能及KEGG通路注釋（圖6）。結果表明，旋覆代赭湯主要通過作用于這些核心Hub基因調控機體各種生物學過程及各種信號通路的轉導以發(fā)揮防治RE的作用。

圖5 六種不同算法的Hub基因

表1 核心Hub基因的功能作用

圖6 核心Hub基因的生物學功能注釋分析和KEGG功能注釋分析

2.6 旋覆代赭湯作用于RE的Hub基因與KEGG關系網絡分析 將得到的旋覆代赭湯治療RE涉及的主要通路與核心Hub基因文件導入Cytoscape3.7.1軟件構建“Hub基因-KEGG”關系網絡圖（圖7）。該網絡由26個節(jié)點（6個Hub基因節(jié)點和20個通路節(jié)點）和77條邊組成，其中三角形代表通路、圓形代表Hub基因，且節(jié)點形狀越大表示在該網絡中所占權重越大。由圖可知，AKT1、EGFR、VEGFA、JUN基因和癌癥通路（hsa05200）、癌癥中蛋白多糖通路（hsa05205）、PI3K-Akt 信號通路（hsa04151）、ErbB 信 號 通 路（hsa04012）、HIF-1信 號 通 路（hsa04066）、FoxO 信號通路（hsa04068）、黏著斑（hsa04510）、MAPK信號通路（hsa04010）、雌激素信號通路（hsa04915）在該網絡中起到核心調控作用。

圖7 Hub基因-KEGG關系網絡圖

3 討論

在中醫(yī)理論體系中，RE主要表現(xiàn)為胃酸反流、梅核氣、胸痹等。本病的病灶位于胃和食管，與肝、脾、肺、腎、膽密切相關。飲食和情緒等多種因素會導致脾胃功能失調，從而產生RE的癥狀［9-10］。旋覆代赭湯運用中醫(yī)陰陽平衡理論辨證論治，根據中藥配伍規(guī)律，由七味中藥組成。其中，旋覆花含有黃銅類和萜類化合物，具有明顯的抗菌、抗炎、抗氧化以及促進胃腸道蠕動作用，能顯著緩解RE的癥狀；半夏、甘草、生姜是廣泛用于治療胃腸道疾病的中藥，具有抗炎、調節(jié)膽汁分泌和改善胃腸黏膜損傷的作用；代赭石含有鎂離子，其可在胃腸道內形成一定的滲透壓，維持胃腸道內的水分充足，促進胃腸道的規(guī)律性蠕動；大棗和人參含有小檗堿和人參皂苷RH2，對RE具有一定的治療作用［11-12］。中藥中的這些成分可單獨或協(xié)同作用以增強治療效果。簡而言之，旋覆代赭湯的治療效果可能歸因于上述生物活性化合物，但仍需進一步系統(tǒng)探討。

本研究首次在大數據庫挖掘和網絡藥理學分析的基礎上，探索了旋覆代赭湯治療RE的潛在靶點。結果顯示，建立了186個節(jié)點、576個交互作用的藥物成分-靶點網絡，并在藥物靶點和RE差異表達基因之間共發(fā)現(xiàn)了71個交集靶點。在此基礎上，進一步研究了基于交集靶點的PPI網絡、基于中心節(jié)點的功能模塊網絡和Hub基因的提取。這些Hub基因節(jié)點如AKT1、EGFR、VEGFA、JUN、STAT3和MAPK3主要 富集于癌癥通路、PI3K- AKT 信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路和雌激素信號通路等。AKT 即蛋白激酶B，是 PI3K- AKT信號轉導途徑中一個重要的下游因子，在各種細胞的增殖和凋亡中都是必不可少的［13］。先前的薈萃分析表明，AKT1在正常食管-反流性食管炎-Barrett 食管-異型增生-食管腺癌中異常激活，其激活水平與疾病的階段顯著相關［14］。重要的是，AKT1各種中藥的重要藥物靶點［15-16］。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是表皮生長因子細胞增殖及相關信號轉導的受體，是一種酪氨酸激酶激活的跨膜蛋白［17］。研究表明，EGFR在反流性食管炎的發(fā)展進程中表達逐漸升高，且與AKT的表達密切相關。在本研究中，AKT1和EGFR不僅是旋覆代赭湯的重要靶點和RE相關靶點之間發(fā)現(xiàn)的交集靶點，而且是PPI模塊中的樞紐節(jié)點。因此，我們推測AKT1和EGFR等基因可能是旋覆代赭湯治療RE的潛在靶點。

相關研究認為，細胞炎癥因子在RE的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而炎癥因子的激活依賴于細胞內外多條信號通路的轉導。已有研究證實PI3K-AKT信號通路參與體內大多數炎癥反應，且以往的研究也報道顯示AKT與食管的病變密切相關［18］。另外，Zhuang等人也證明PI3K-AKT信號通路的激活在反流性食管炎的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，抑制PI3K-AKT信號通路的轉導科減少多種炎癥因子的釋放，從而控制RE的發(fā)展進程［19］。Rafiee等人的研究表明PI3K-AKT和MAPK調節(jié)的Hsp70和Hsp27的誘導是調節(jié)人食管微血管內皮細胞對酸性pH應激反應的關鍵機制［20］。此外，在反流性食管炎的食管上皮中，MAPK家族蛋白被發(fā)現(xiàn)參與調節(jié)緊密連接蛋白，這些緊密連接蛋白是反流性食管炎的敏感標志［21］。研究顯示，EGFR 在食管角化細胞中過表達介導了PI3K-AKT和MAPK信號通路的激活，從而促進了細胞的增殖和遷移，使得RE向腫瘤化進展［22］。在本研究中，KEGG通路分析表明AKT1和EGFR等Hub基因主要富集在PI3K-AKT信號通路和MAPK信號通路中。因此，我們推測旋覆代赭湯治療RE的效用可能是通過靶向AKT1和EGFR等PI3K-AKT信號通路和MAPK信號轉導途徑來實現(xiàn)的。

綜上所述，通過網絡藥理學方法清晰地闡明了旋覆代赭湯抑制炎癥反應的多靶點、多組分作用特點。我們通過幾個數據庫確定了與旋覆代赭湯和RE相關的潛在靶點。然后，將兩類靶點合并取交集獲得交集靶點，再將交集靶點進行PPI分析，從交集靶點的PPI網絡中得到最重要功能模塊及核心Hub基因。最后，我們進行了功能富集分析，以闡明旋覆代赭湯治療RE的多種機制。旋覆代赭湯治療RE的直接途徑有細胞增殖的調控、脂多糖介導的信號轉導、MAPK級聯(lián)反應和PI3K-AKT信號通路信號通路等。將相關結果與RE的現(xiàn)有治療方法相結合，我們認為旋覆代赭湯在治療RE時具有抑制炎癥級聯(lián)反應和細胞增殖的作用。