張楊，王剛，陳俠，張云志，秋彤，高飛

陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，陜西咸陽712000

流行病學調(diào)查顯示，非小細胞肺癌（NSCLC）發(fā)病率約占肺癌的80.0%［1-2］。肺癌根治術是目前Ⅰ～Ⅲa期NSCLC 的主要治療手段，但仍有25.0%～30.0%的患者術后會發(fā)生局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，且術后5年生存率僅50%～70%［3-4］。肺組織特異度蛋白X（LUNX）是肺組織特異性表達基因，在肺癌組織中呈特異性高表達［5］。乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）在調(diào)節(jié)細胞周期、轉(zhuǎn)錄、泛素化及細胞凋亡等方面具有重要作用，其功能缺失可增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［6］。本研究觀察了 NSCLC 組織 BCRP、LUNX mRNA 的表達變化，并探討其在NSCLC 診斷、疾病進展評估及預后判斷中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2013 年 3 月—2016 年 3 月我院收集的NSCLC組織54例份作為觀察組，患者均符合《2015 SCAN 指南：晚期非小細胞肺癌的系統(tǒng)治療》［7］中的NSCLC診斷標準，并經(jīng)病理組織學檢查證實為NSCLC，預計生存時間＞4 個月；排除近期有放化療治療史者，合并惡性心包積液或胸腔積液者，合并肺結(jié)核、肺大皰、急性肺部感染或氣胸者，重度失語癥、阿爾茨海默病或精神行為異常者。另選取正常肺組織24例份作為對照組。觀察組患者男35例、女19例，年齡37～74（51.82± 6.01）歲，BMI 17.30～26.30（22.90± 1.35）kg/m2。對照組患者男15例、女9例，年齡 35～72（52.23 ± 5.93）歲，BMI 17.00～26.50（23.08±1.40）kg/m2。兩組患者一般資料均具有可比性（P均＞0.05）。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 組織BCRP、LUNX mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取兩組組織，TRIzol 試劑提取總RNA，并采用瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA完整性，檢測總RNA濃度、純度合格后，應用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄已定量RNA 為cDNA。BCRP引物序列：上游引物5'-CTGAGATCCT?GAGCCTTTGG-3'、下 游引 物 5'-TGCCCATCACAA?CATCATCT-3'，內(nèi)參基因GAPDH 引物序列：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'、下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。LUNX 引物序列：上 游 引 物 5′-CTCATTGTCTTCTACGGGCTGTTAG-3'、下游引物 5'-CTTTATGCCGAGAGGGATGGT-3'，內(nèi)參基因GAPDH 引物序列：上游引物5'-ACAGT?CAGCCGCATCTTCTTT-3'、下游引物 5'-CCATCAC?GCCACAGTRCC-3'。PCR反應體系25 μL：PCR reac?tion m ixture 12μL，特異性上、下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，cDNA 模板 1 μL，加水補足25 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，反復32 個循環(huán)，最終72 ℃延伸 8 min。采用 2－ΔΔCt法計算 BCRP、LUNX mRNA 相對表達量。

1.3 預后隨訪方法 采用電話或住院病歷隨訪等方式對觀察組患者進行隨訪，隨訪時間截至2020 年3月，記錄患者中位生存時間。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，結(jié)果比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例或率表示，結(jié)果比較采用χ2檢驗。觀察組BCRP、LUNX mRNA 表達量的關系采用Spearman 相關性分析。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析BCRP、LUNX mRNA 單一及聯(lián)合診斷NSCLC 的價值。以BCRP、LUNX mRNA 表達量中位數(shù)為界限，≤中位數(shù)為低表達者，＞中位數(shù)為高表達者，繪制BCRP、LUNX 高表達者與低表達者的Kaplan-Meier 生存曲線，采用Log-Rank檢驗比較其生存時間。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組組織BCRP、LUNX mRNA 相對表達量比較 觀察組與對照組BCRP mRNA 相對表達量分別為0.60± 0.27、0.19 ± 0.09，LUNX mRNA 相對表達量分別為12.94±2.10、9.41±4.25；兩組比較P均＜0.05。觀察組BCRP、LUNX mRNA 相對表達量呈正相關關系（r=0.426，P＜0.01）。

2.2 BCRP、LUNX 單一及聯(lián)合診斷 NSCLC 的價值比較 見表1。

表1 BCRP、LUNX單一及聯(lián)合診斷NSCLC的價值比較

2.3 觀察組不同臨床病理參數(shù)患者癌組織BCRP、LUNX mRNA表達比較 見表2。

2.4 觀察組BCRP、LUNX 高低表達患者的預后比較 觀察組BCRP高表達28例、低表達24例，其中位生存時間分別為 26、45 個月，二者比較P＜0.05。LUNX高表達30例、低表達24例，其中位生存時間分別為35、48 個月，二者比較P＜0.05。觀察組BCRP、LUNX高低表達患者的生存曲線見圖1。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是導致NSCLC 患者治療失敗及死亡的主要原因［8-9］。受化療藥物高毒性及耐藥性影響，NSCLC患者的中位生存期不甚理想［10-11］。同時，CT、病理檢查、磁共振成像等常規(guī)檢查方法難以有效檢出腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，研究NSCLC 發(fā)生、進展及轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找相關生物學標志物是現(xiàn)階段腫瘤學研究領域熱點之一。越來越多研究證實，微轉(zhuǎn)移是腫瘤患者預后不良的獨立危險因素，而淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是NSCLC 患者預后不良的主要原因［12-13］。LUNX 在NSCLC 組織中特異表達，既往研究認為LUNX 可作為預測NSCLC 轉(zhuǎn)移或復發(fā)的指標，可輔助診斷NSCLC 微轉(zhuǎn)移［14］。但本研究結(jié)果表明，癌組織中LUNX mRNA表達與NSCLC患者的性別、年齡、組織學分型、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關性，其原因可能與LUNX 表達主要來源于轉(zhuǎn)移的癌細胞有關。本研究結(jié)果顯示，LUNX 高表達患者的生存時間明顯短于低表達患者。趙霞等［15］以87 例NSCLC 患者為研究對象，隨訪顯示LUNX mRNA 高表達患者中位生存期僅34.36 個月，是影響NSCLC 患者預后的獨立危險因素。這提示LUNX可作為判斷NSCLC 預后的新靶點。分析原因，LUNX mRNA 表達上調(diào)可增加腫瘤負荷，破壞機體防御腫瘤浸潤的自然屏障，從而加重腫瘤細胞浸潤，提高NSCLC患者術后轉(zhuǎn)移或復發(fā)風險。

表2 觀察組不同臨床病理參數(shù)患者癌組織BCRP、LUNX mRNA表達比較（±s）

表2 觀察組不同臨床病理參數(shù)患者癌組織BCRP、LUNX mRNA表達比較（±s）

臨床病理參數(shù)性別男 女年齡（歲）≥50＜50組織學分型鱗癌腺癌臨床分期Ⅰ期Ⅱ、Ⅲ期分化程度高分化中、低分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是 否n 35 19 41 13 22 32 29 25 30 24 24 30 BCRP mRNA相對表達量0.63±0.24 0.54±0.21 0.62±0.25 0.54±0.23 0.61±0.31 0.59±0.26 0.65±0.26 0.54±0.28 0.69±0.22 0.50±0.19 0.59±0.27 0.61±0.32 t 1.373 1.024 0.257 1.496 3.347 0.244 P 0.176 0.311 0.798 0.141 0.002 0.808 LUNX mRNA相對表達量12.08±4.38 14.52±5.14 12.85±3.69 13.22±4.14 11.56±6.74 13.58±6.14 12.02±5.74 14.17±7.19 14.18±6.28 12.14±4.17 12.12±3.47 13.40±6.25 t 1.839 0.306 1.142 1.221 1.367 0.898 P 0.072 0.761 0.259 0.227 0.178 0.374

圖1 觀察組BCRP、LUNX高低表達患者的生存曲線

BCRP 是細胞內(nèi)的重要銜接蛋白，主要受整合素信號途徑調(diào)控，參與氨基酸、毒素、糖等轉(zhuǎn)運，在乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、前列腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤等多種腫瘤中呈高表達［16-17］。研究表明，BCRP 通過與細胞表面生長因子受體結(jié)合，可刺激細胞表面生長因子受體活化，抑制NSCLC 癌細胞凋亡；同時BCRP還能發(fā)生突變，幫助細胞逃避凋亡，誘導Grb2 與Shp-2 結(jié)合，刺激Ras/Raf/絲裂原激活蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號途徑，從而導致癌細胞異常增殖［19］。本研究結(jié)果顯示，NSCLC 組織中 BCRP mRNA 表達量明顯高于正常肺組織，且NSCLC 組織中BCRP表達與分化程度有關，推測BCRP可能參與了NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展過程。BCRP 可直接參與v-Crk 及 v-Src 癌蛋白信號通路，上調(diào) p-p38 表達，影響癌細胞生長、分化；同時可以促進致癌性轉(zhuǎn)化，進而增強癌細胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力，誘導腫瘤分化，加重腫瘤惡性程度，明顯增加轉(zhuǎn)移復發(fā)風險。本研究結(jié)果顯示，BCRP 高表達患者的生存時間明顯短于低表達患者，提示可作為評估NSCLC 患者預后的潛在預測因子，為腫瘤靶向治療提供新方向。分析原因，BCRP 表達上調(diào)一定程度上會特異性轉(zhuǎn)運甲氨蝶呤、米托蒽醌等多種抗腫瘤藥物，強化抑制胱門蛋酶及化療藥物誘導凋亡活性，增強腫瘤細胞耐藥性，參與原發(fā)性耐藥的形成［18-19］。同時，本研究顯示BCRP mRNA 單獨診斷的NSCLC 靈敏度偏低（46.30%），而BCRP、LUNX mRNA 聯(lián)合診斷 NSCLC 的 AUC 最大（0.824），靈敏度可達70.37%，提示BCRP、LUNX 聯(lián)合檢測在NSCLC診斷方面具有良好的應用前景。

綜上所述，NSCLC 組織中 BCRP、LUNX 表達均升高，且BCRP 高表達與腫瘤分化程度有關，二者聯(lián)合檢測有助于NSCLC 患者的診斷和預后判斷，有望成為NSCLC診斷及預后判斷的新靶點。