陳雄飛，丁立爽，孔德帥，趙秀雷，廖麗麗，張耀敏，李鳳山，劉汝海

滄州市中心醫(yī)院，河北滄州061001

肝細(xì)胞癌是起源于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，我國肝細(xì)胞癌患者多存在乙型病毒型肝炎病史，患者就診時多屬中晚期，根治性切除手術(shù)成功率低，術(shù)后復(fù)發(fā)率高［1-2］。肝細(xì)胞癌通常為富血供腫瘤，腫瘤供血動脈主要是肝動脈，經(jīng)肝動脈化療栓塞（TACE）是肝細(xì)胞癌術(shù)后重要的輔助治療手段［3］，也是中晚期肝細(xì)胞癌患者的重要治療方法［4］。5-氟尿嘧啶（5-Fu）是細(xì)胞周期特異性藥物，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為有效的5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸后，通過阻斷胸腺嘧啶核苷酸合成酶而干擾DNA 的合成，主要應(yīng)用于消化道腫瘤和實體腫瘤的化療。肝細(xì)胞癌細(xì)胞的異質(zhì)性及耐藥性可導(dǎo)致其對5-Fu 的敏感性降低，這與肝細(xì)胞癌差異表達(dá)耐藥相關(guān)蛋白有關(guān)。離子通道相關(guān)蛋白在腫瘤進(jìn)展的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中具有重要作用，與腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性相關(guān)。FXYD 離子轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)因子6（FXYD6）是鈉鉀泵的重要調(diào)節(jié)亞基，也是腫瘤相關(guān)蛋白，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)［5-8］。前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XYD6 蛋白在肝細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)，在體外可通過上調(diào)鈉鉀泵的α1亞基，激活其下游Src-ERK 信號傳導(dǎo)通路，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移［6］。目前，F(xiàn)XYD6 蛋白在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對細(xì)胞化療敏感性的影響鮮見報道。為此，我們于 2019 年 4 月—2020 年 3 月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2、SNU449、Huh-7、SMMC7721 及人正常肝細(xì)胞 HL-7702（L-02）均購自美國 ATCC 細(xì)胞庫。質(zhì)粒：對照空載體真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNATM3.1/Vector 購自日本TaKaRa 公司，真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNATM3.1/FXYD6 為前期制備［9］。主要試劑：LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司，胰蛋白酶、青—鏈霉素混合液購自美國Gibco 公司，鼠抗hFXYD6 單克隆抗體為前期制備［10］；Western blot Kit高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物有限公司，HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 購自北京索萊寶科技有限公司，MTT 檢測試劑盒、GAPDH 單克隆抗體、Caspase-3 單克隆抗體均購自英國Abcam公司，Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 肝細(xì)胞癌細(xì)胞的篩選 采用Western blotting法 。 取 對 數(shù) 生 長 期 的 HepG2、SNU449、Huh-7、SMMC7721及對照L-02細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上；分別加入FXYD6、GAPDH 一抗（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶2 000），室溫孵育1 h，PBST清洗3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵化45 min，PBST 清洗 3 次。以 GAPDH 為內(nèi)參，采用 Western blot Kit 高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測目的蛋白條帶。結(jié)果顯示，F(xiàn)XYD6蛋白在HepG2、SNU449、Huh-7 細(xì)胞中高表達(dá)，而在SMMC7721 細(xì)胞和對照L-02 細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)，見圖1。因SMCC7721低表達(dá)FXYD6 蛋白，故選取SMMC7721 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 FXYD6蛋白在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系及對照L-02細(xì)胞中的表達(dá)條帶圖（Western blotting法）

1.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染處理 將肝細(xì)胞癌SMMC7721細(xì)胞在RPMI 1640 培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，待培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶消化，以3×105/孔接種于4 孔板中，加入完全培養(yǎng)液。待細(xì)胞融合度達(dá)80%，隨機(jī)分為過表達(dá)組和對照組。過表達(dá)組和對照組分別加入100 μL 無血清RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋的 pcDNA3.1/FXYD6、pcDNA3.1/Vector 真核質(zhì)粒（各2 μg），加入轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 溶液10 μL，輕輕混勻。室溫孵育30 min，用無血清RPMI 1640 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h 后加入2 mg/mL 含G418 的完全培養(yǎng)液篩選陽性克隆，待克隆形成后，分別挑選質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的SMMC7721 抗性克隆，并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT 法。取兩組轉(zhuǎn)染后的抗性克隆細(xì)胞，胰酶消化后，以5×103/孔接種于 96 孔板中，分別加入終濃度為 0、12.5、25、50、100 μg/mL 的5-Fu 100 μL，在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、36、48 h。每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄孔內(nèi)液體，加入150 μL二甲基亞砜，脫色搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在 2500 型 BIO-RAD 酶標(biāo)儀上檢測 490 nm 處的光密度（OD）值，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗孔OD 值）/對照孔OD 值×100%。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞凋亡能力觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取兩組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，胰酶消化后，以5×103/孔接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，并加入終濃度為25μg/L 的5-Fu作用48 h。干預(yù)結(jié)束后，用70%乙醇固定細(xì)胞，并根據(jù)試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行Annexin V 及PI染色。避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較和組內(nèi)比較分別采用成組t檢驗和配對t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組經(jīng)不同濃度5-Fu作用后的細(xì)胞增殖抑制率比較 隨著5-Fu濃度增加和作用時間延長，兩組細(xì)胞增殖抑制率均呈升高趨勢。5-Fu濃度為12.5μg/mL時，兩組作用24、36、48 h的細(xì)胞增殖抑制率比較均無明顯差異（P均＞0.05）；5-Fu濃度為25、50、100μg/mL時，過表達(dá)組作用24、36、48 h 的細(xì)胞增殖抑制率均明顯低于對照組同時間點（P均＜0.01）。見表1。

表1 兩組經(jīng)不同濃度5-Fu作用后的細(xì)胞增殖抑制率比較（-x± s）

2.2 兩組細(xì)胞凋亡率比較 觀察組細(xì)胞凋亡率為35.62% ± 3.98%，對照組為46.19% ± 6.60%，兩組比較P＜0.01。

3 討論

乙型肝炎病毒感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變最主要的原因，絕大部分患者感染乙型肝炎病毒后，肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生長導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生，最終發(fā)展為肝細(xì)胞癌［11-12］。肝細(xì)胞癌起病隱匿，早期就診率低，根治性切除率低，根治性切除術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)70%［13］。目前化療是肝細(xì)胞癌治療的一個輔助手段，5-Fu 是局部或全身化療過程中常用的化療藥物，可通過阻斷胸腺嘧啶合成，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。研究顯示，以5-Fu 為基礎(chǔ)的化療方案在晚期肝細(xì)胞癌患者的腫瘤反應(yīng)和生存方面顯示出一定優(yōu)勢［14］。但很多肝細(xì)胞癌患者對5-Fu 天然耐藥或在治療過程中產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致5-Fu 化療效果降低，引起肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，是化療失敗的主要原因，這與肝細(xì)胞癌藥物治療靶點缺乏和抗癌藥耐藥性增加有關(guān)［15］。因此，尋找與肝細(xì)胞癌化療耐藥相關(guān)的蛋白，將為改善肝細(xì)胞癌患者預(yù)后提供新思路。

膜轉(zhuǎn)運蛋白參與維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及臨床藥物耐藥性等細(xì)胞功能，已成為癌癥治療的新靶標(biāo)［16］。鈉鉀泵是由不同的α 和β 亞基組成的同工酶，在維持細(xì)胞穩(wěn)定性方面具有重要作用，其在細(xì)胞黏附中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，是抗癌治療的重要靶標(biāo)［17］。鈉—鉀泵抑制劑可提高傳統(tǒng)放、化療不敏感腫瘤的放化療敏感性［18］。FXYD6 蛋白為離子通道相關(guān)蛋白，是鈉—鉀泵的調(diào)節(jié)亞基，在維持細(xì)胞鈉、鉀離子跨膜濃度梯度方面具有重要作用。FXYD6 蛋白也是腫瘤相關(guān)蛋白，目前尚無研究表明FXYD6 差異表達(dá)與肝細(xì)胞癌耐藥相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)XYD6 蛋白在肝細(xì)胞癌HepG2、SNU449、Huh-7 細(xì)胞中高表達(dá)，而在肝細(xì)胞癌SMMC7721 細(xì)胞和對照L-02 細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)；提示FXYD6蛋白在不同的肝細(xì)胞癌細(xì)胞中存在差異表達(dá)，并選擇FXYD6 低表達(dá)的SMMC7721 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。本研究結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加和作用時間延長，兩組細(xì)胞增殖抑制率均呈升高趨勢；5-Fu 濃度為12.5 μg/mL 時，兩組作用24、36、48 h 的細(xì)胞增殖抑制率比較均無明顯差異；5-Fu 濃度為 25、50、100 μg/mL 時，過表達(dá)組作用 24、36、48 h 的細(xì)胞增殖抑制率均明顯低于對照組同時間點。因臨床工作中化療患者5-Fu 基本上是作用48 h，而 12.5 μg/L 5-Fu 作用后兩組細(xì)胞增殖抑制率沒有統(tǒng)計學(xué)差異，因此選擇25μg/L 5-Fu作用48 h進(jìn)行細(xì)胞凋亡實驗；結(jié)果顯示，觀察組細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組。以上均說明，F(xiàn)XYD6可降低5-Fu對肝細(xì)胞癌SMMC7721細(xì)胞的化療敏感性。既往研究顯示，5-Fu 的癌細(xì)胞耐藥機(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)藥物富集減少、凋亡相關(guān)蛋白異常表達(dá)，細(xì)胞凋亡減少、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)異常等［19］。本研究FXYD6 蛋白表達(dá)升高促進(jìn)了SMMC7721 細(xì)胞對5-Fu 的化療耐藥性，其機(jī)制可能與通過影響鈉—鉀泵活性而減少細(xì)胞凋亡有關(guān)，仍需進(jìn)一步證實。

綜上所述，F(xiàn)XYD6 蛋白過表達(dá)可降低肝細(xì)胞癌SMMC7721 細(xì)胞對5-Fu 的化療敏感性。靶向調(diào)控FXYD6 蛋白表達(dá)有望成為提高肝細(xì)胞癌患者化療敏感性的有效手段，但是其在體內(nèi)對肝細(xì)胞癌細(xì)胞化療敏感性的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步驗證。