李志樂，韋秋宇，言緯，劉莉，黃照河，韋寶敏

右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色533000

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是心血管疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)與病理基礎(chǔ)，慢性炎癥反應(yīng)參與其發(fā)生發(fā)展的過程［1］。炎癥反應(yīng)過程中可釋放細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致斑塊破裂、血栓形成，從而參與了AS 的發(fā)生。白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和γ-干擾素（IFN-γ）均是促進(jìn)AS 發(fā)生發(fā)展的炎性因子［2-3］，而白細(xì)胞介素10（IL-10）可通過抗炎及調(diào)控線粒體自噬發(fā)揮抑制AS 的作用［4］。B7-H3、B7-H4 是近年新發(fā)現(xiàn)的 B7 家族成員，作為負(fù)性協(xié)同刺激因子能抑制CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞的活化與增殖［5-6］。目前，關(guān)于B7-H3、B7-H4 的生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制仍有爭議，其在AS 發(fā)生發(fā)展中的炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。2018年 9 月—2020 年 6 月，本研究觀察了 AS 兔血清、外周血單核細(xì)胞、主動(dòng)脈組織中協(xié)同刺激因子B7-H3、B7-H4 的表達(dá)變化，并分析其與IL-10、IL-1β、IFN-γ表達(dá)的關(guān)系，為探索B7-H3、B7-H4影響AS發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年健康新西蘭大白兔20只，清潔級(jí)，雄性，3 月齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK 桂2012-0003，購自右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要藥物及試劑：膽固醇購自安徽天啟化工公司，蛋黃粉購自毫州市紅日實(shí)業(yè)有限公司；ELISA 試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司，TRIzol試劑盒購自美國Invitrigen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海睿時(shí)生物科技有限公司，Real Master Mix試劑盒購自北京TIANGE公司。

1.2 動(dòng)物分組、造模與標(biāo)本獲取 選取20 只成年健康雄性新西蘭大白兔，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為AS組和對照組，各10 只。AS 組持續(xù)給予高脂飲食14周，對照組給予普通飲食14周，高脂飲食由3.0%膽固醇、8.5%蛋黃粉、8.5%豬油和80%普通動(dòng)物飼料制成。實(shí)驗(yàn)前后0周、14周采集兔耳緣靜脈血，14周末處死并留取主動(dòng)脈，部分行主動(dòng)脈病理檢測，剩余置于液氮中行PCR檢測。

1.3 血脂水平檢測 兩組分組處理前（0周）和分組處理14周末，在空腹情況下，分別采集兔耳緣靜脈血2 mL，靜置30 min后3 000 r/min離心15 min，分離血清。采用7170 型全自動(dòng)生化分析儀檢測血脂水平，包括總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

1.4 主動(dòng)脈形態(tài)及病理觀察 采用HE 染色。兩組分組處理14 周末，采集耳緣靜脈血后進(jìn)行處死。分離兔主動(dòng)脈弓起始處至胸主動(dòng)脈段，生理鹽水沖洗并分離主動(dòng)脈，剪取同一部位0.5～1.0 cm 長的血管段，置于10%緩沖甲醛液中固定24 h，石蠟包埋，剩余置于液氮中保存?zhèn)溆?。取石蠟?biāo)本，血管橫斷面連續(xù)切片，厚度約為5μm，常規(guī)進(jìn)行HE 染色。DMR+550 型病理圖像分析儀測定粥樣斑塊最大橫截面積、主動(dòng)脈橫截面積和內(nèi)膜厚度，斑塊面積比=粥樣斑塊最大橫截面積/主動(dòng)脈橫截面積×100%。將剩余的主動(dòng)脈從背側(cè)面縱行正中線剪開、鋪平，用NIKON100 對鋪平的主動(dòng)脈進(jìn)行攝像，將照片輸入計(jì)算機(jī)，觀察脂質(zhì)條紋、斑塊破裂及血栓形成等病理情況。

1.5 血清炎性因子及sB7-H3、sB7-H4水平檢測 采用ELISA 法。取1.3 中分離的血清，按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測兩組血清炎性因子IL-1β、IFN-γ、IL-10及sB7-H3、sB7-H4水平。

1.6 外周血單核細(xì)胞與主動(dòng)脈組織B7-H3、B7-H4 mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。兩組分組處理14周末，采用密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞。取兩組外周血單核細(xì)胞及液氮凍存的主動(dòng)脈組織，采用TRIzol 法提取總RNA，測定260、280 nm 處的光密度值及其完整性，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)。B7-H3、B7-H4 及內(nèi)參 β-actin 引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃、15 s，58 ℃、15 s，68 ℃、31 s，共 45 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。采用 2－ΔΔCt法計(jì)算B7-H3、B7-H4 mRNA相對表達(dá)量。

表1 B7-H3、B7-H4及內(nèi)參β-actin引物序列及擴(kuò)增長度

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以-x±s表示，結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)；血清sB7-H3、sB7-H4 與 IL-1β、IFN-γ、IL-10 的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組兔不同時(shí)間點(diǎn)血脂水平比較 見表2。

表2 兩組兔不同時(shí)間點(diǎn)血脂水平比較（mmol/L，±s）

表2 兩組兔不同時(shí)間點(diǎn)血脂水平比較（mmol/L，±s）

注：與同組0周比較，*P＜0.05；與對照組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05。

組別AS組0周14周對照組0周14周n 10 10 TC 1.04±0.22 28.29±5.50*#0.98±0.25 1.37±0.34 TG 0.75±0.11 2.79±0.36*#0.78±0.09 0.87±0.15 LDL-C 0.82±0.26 30.36±2.71*#0.80±0.32 0.85±0.27 HDL-C 1.83±0.27 1.37±0.37*#1.75±0.12 1.82±0.33

2.2 兩組兔主動(dòng)脈形態(tài)及病理比較 ①主動(dòng)脈形態(tài)：對照組兔主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑、平坦、完整。AS組兔主動(dòng)脈病灶呈彌漫性、顆粒狀及息肉狀，甚至不規(guī)則改變，較嚴(yán)重者斑塊融合成片，可見脂樣物質(zhì)突出管腔，邊緣粗糙。②主動(dòng)脈病理改變：對照組兔主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜、中膜及外膜組織結(jié)構(gòu)正常，光滑完整。AS 組主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增生增厚，血管內(nèi)膜下可見泡沫細(xì)胞與脂質(zhì)沉積，形成粥樣脂質(zhì)斑塊，局部鈣化，中膜平滑肌細(xì)胞增生，呈典型AS 病理改變。AS 組兔斑塊面積比 為 66.82% ± 15.45%、內(nèi) 膜 厚 度（86.02 ±12.32）μm，對照組分別為 0、（8.12 ± 3.85）μm；兩組比較P均＜0.05。

2.3 兩組兔血清 IL-1β、IFN-γ、IL-10 及 sB7-H3、sB7-H4水平比較 14周時(shí)，AS組兔血清IL-1β、IFN-γ 水平均高于同組0周及對照組同時(shí)間點(diǎn)，而IL-10、sB7-H3 及sB7-H4 水平均低于同組0 周及對照組同時(shí)間點(diǎn)（P均＜0.05）。見表3。

表3 兩組兔血清IL-1β、IFN-γ、IL-10及sB7-H3、sB7-H4水平比較（ng/L，-x± s）

2.4 兩組兔外周血單核細(xì)胞與主動(dòng)脈組織B7-H3、 B7-H4 mRNA表達(dá)比較 見表4。

表4 兩組兔外周血單核細(xì)胞與主動(dòng)脈組織B7-H3、B7-H4 mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 兩組兔外周血單核細(xì)胞與主動(dòng)脈組織B7-H3、B7-H4 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別AS組對照組n 10 10 B7-H3單核細(xì)胞0.533±0.182*0.958±0.206主動(dòng)脈0.516±0.165*0.899±0.192 B7-H4單核細(xì)胞0.612±0.204*0.983±0.175主動(dòng)脈0.497±0.216*0.862±0.163

2.5 血清B7-H3、B7-H4 與IL-1β、IFN-γ、IL-10 的相關(guān)性分析結(jié)果 血清sB7-H3與IL-1β、IFN-γ 均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r分別為-0.554、-0.534，P均＜0.05），與IL-10 呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.692，P＜0.05）。血清sB7-H4 與 IL-1β、IFN- γ 均 呈 負(fù) 相 關(guān) 關(guān) 系（r分 別為-0.485、-0.466，P均＜0.05），與IL-10 呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.676，P＜0.05）。

3 討論

目前認(rèn)為，AS是一種以劇烈的免疫活動(dòng)為特征的慢性炎癥性疾病，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞參與，因此炎癥免疫反應(yīng)在AS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫性疾病可導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)病率和病死率增加，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率約為健康對照組的2 倍，這可能與免疫功能失調(diào)和慢性炎癥等因素有關(guān)［8-9］。CD4+T 細(xì)胞誘導(dǎo)的抗原特異性免疫反應(yīng)是近年來AS 炎癥反應(yīng)機(jī)制中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。B7 家族是免疫球蛋白超家族，B7-H3 是新發(fā)現(xiàn)的B7家族成員，與慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在高血壓合并頸AS 患者中呈高表達(dá)［10］。B7-H4 是另一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的B7 家族成員，能抑制CD4+和CD8+T 細(xì)胞增殖，減少炎性因子產(chǎn)生，進(jìn)而負(fù)性調(diào)控T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答［11-12］。目前，協(xié)同刺激分子B7-H3、B7-H4在免疫調(diào)節(jié)方面的生物學(xué)功能已經(jīng)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，但其在AS炎癥反應(yīng)中的作用鮮見報(bào)道。

本研究對大白兔給予高脂飲食14 周后，AS 組兔血清TC、TG 及LDL-C水平較同組0周及對照組同時(shí)間點(diǎn)均明顯升高，而HDL-C 水平顯著低于同組0周及對照組同時(shí)間點(diǎn)；在主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)方面，AS 組兔主動(dòng)脈病灶呈彌漫性，呈灰白色顆粒狀、息肉狀、不規(guī)則或橢圓形，較嚴(yán)重者斑塊融合成片，可見脂樣物質(zhì)突出管腔，邊緣粗糙；在主動(dòng)脈病理學(xué)方面，AS組兔主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增生增厚，血管內(nèi)膜下可見泡沫細(xì)胞與脂質(zhì)沉積，形成粥樣脂質(zhì)斑塊，局部鈣化，中膜平滑肌細(xì)胞增生，呈典型AS 的病理改變；且AS組兔主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度與粥樣斑塊面積比均明顯高于對照組，證實(shí)成功構(gòu)建AS兔模型。

既往研究表明，IL-10 作為抗AS 的炎性因子，由Th2 細(xì)胞分泌，可抑制巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，具有逆轉(zhuǎn)與穩(wěn)定AS斑塊的作用［13］。另有研究發(fā)現(xiàn)，人類抗原呈遞細(xì)胞中B7-H4 表達(dá)顯著增強(qiáng)，是通過IL-10自分泌的方式刺激導(dǎo)致的，提示IL-10 參與上調(diào)B7-H4 表達(dá)［14］；同時(shí)，B7-H3、B7-H4 也可通過促進(jìn) IL-10分泌的方式抑制炎癥反應(yīng)［15］。這提示在AS 進(jìn)展過程中，B7-H3、B7-H4可能通過促進(jìn)IL-10分泌介導(dǎo)抗AS 炎癥反應(yīng)。IL-1β、IFN-γ 均是參與介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)而促進(jìn)AS 進(jìn)展的炎性因子，主要由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，通過炎癥小體的組裝介導(dǎo) Caspase-1 激活，從而調(diào)控炎癥反應(yīng)［16-17］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，B7-H3可抑制IL-1β、IFN-γ 等炎性因子的分泌與激活，而IL-1β、IFN-γ 在 B7-H4-/-小鼠中的表達(dá)明顯升高。臨床研究表明，抑制IL-1β 表達(dá)可治療多種慢性炎癥性疾病，表明IL-1β 可作為臨床上AS 抗炎治療的潛在靶點(diǎn)［18］。本研究結(jié)果顯示，AS組14 周兔血清sB7-H3、sB7-H4 水平及外周血單核細(xì)胞和主動(dòng)脈B7-H3、B7-H4 mRNA 表達(dá)較對照組均明顯下降，而血清IL-1β、IFN-γ 水平上調(diào)，進(jìn)一步行Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清sB7-H3、sB7-H4分別與IL-1β、IFN-γ 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。由此我們推測，B7-H3、B7-H4可能通過介導(dǎo)抑制IL-1β、IFN-γ表達(dá)來抗AS 炎癥反應(yīng)，而IL-10 可抑制T淋巴細(xì)胞凋亡，減少IL-1β、IFN-γ 等炎性因子的分泌，抑制炎性反應(yīng)，減輕炎癥對血管的損傷。協(xié)同刺激因子B7-H3、B7-H4 在AS 炎癥反應(yīng)過程中起到中樞調(diào)節(jié)作用，可能通過促進(jìn) IL-10 分泌及抑制IL-1β、IFN-γ 表達(dá)，以減輕AS炎癥反應(yīng)，為AS炎性反應(yīng)中的保護(hù)性因子。

綜上所述，AS兔血清、外周血單核細(xì)胞、主動(dòng)脈組織協(xié)同刺激分子B7-H3、B7-H4 表達(dá)均降低，B7-H3、B7-H4 可減輕AS 炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與促進(jìn)IL-10分泌及抑制IL-1β、IFN-γ表達(dá)有關(guān)，B7-H3、B7-H4有望成為AS防治的新靶點(diǎn)。