陳睿，馬騫，傅建芳，張婧，朱軍，王偉東，王旁

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，西安710032

阿霉素是治療腫瘤的常用藥，但會(huì)引起比較嚴(yán)重的心臟不良反應(yīng)，導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制［1-2］。外泌體是細(xì)胞分泌的一種直徑為30～200 nm 的脂質(zhì)雙分子膜結(jié)構(gòu)囊泡，在多種疾病的發(fā)生和治療過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）來(lái)源外泌體在治療炎癥和退行性疾病方面均具有良好療效［3］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）來(lái)源外泌體被證實(shí)能夠減小心肌梗死面積，改善心功能［4］。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（mADSC）的生物學(xué)特性及免疫標(biāo)志物與 BMSCs 基本相似［5］，因此，mADSC 來(lái)源外泌體可能發(fā)揮與BMSCs 外泌體相似的作用，但目前關(guān)于mADSC 來(lái)源外泌體對(duì)阿霉素所致心肌損傷的影響及其機(jī)制鮮有報(bào)道。為此，我們于2019 年2 月—2020年5月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性C57 小鼠30 只，6～8 周齡，均購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，于SPF條件下飼養(yǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均符合空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)制定標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞：心肌細(xì)胞H9C2 購(gòu)自陜西帆昌生物科技有限公司。主要試劑：阿霉素購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、Ⅰ型膠原酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，雙抗購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司，外泌體提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)System Biosciences 公司，TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州碧云天生物科技有限公司，DiI染料購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司；外泌體表面標(biāo)志物 CD81、TSG101、GAPDH 及高爾基體標(biāo)記物GM130 均購(gòu)自美國(guó) CST 公司，mADSC 表面標(biāo)志物CD29、CD90 和粒細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD34、CD45 抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；QIAQuick PCR純化試劑盒、miRNA qRT-PCR 試劑盒、miR-21a-5p 引物均購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。主要儀器：Western blot?ting 電泳儀及相關(guān)成像設(shè)備購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，激光共聚焦掃描系統(tǒng)購(gòu)自日本Olympus 公司，Vevo 2100 超聲成像儀購(gòu)自加拿大Visual Sonics 公司。

1.2 外泌體的提取、培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 mADSC 的提取與培養(yǎng) 取雄性C57 小鼠3只，無(wú)菌條件下采集皮下脂肪組織，用眼科剪剪碎至糜狀，置于無(wú)菌離心管中。加入0.5%Ⅰ型膠原酶，避光消化45 min，加入等體積α-MEM 培養(yǎng)基終止消化。將上述混合物通過(guò)200 目無(wú)菌鋼篩過(guò)濾，收集過(guò)濾物于無(wú)菌離心管中，1 500 g 離心5 min、離心半徑13.5 cm。棄上清后加入等體積紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解5 min。在4 ℃環(huán)境下離心后，加入α-MEM完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液鋪于培養(yǎng)皿中。24 h 后換液去除未貼壁細(xì)胞，待生長(zhǎng)融合度達(dá)80%后，按照1∶2 比例進(jìn)行傳代。光鏡下觀察顯示提取的細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形，在脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)可誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞，油紅染色可見(jiàn)脂滴形成；在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)可誘導(dǎo)為骨細(xì)胞，茜素紅染色可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示提取的細(xì)胞表面高表達(dá)CD29、CD90，不表達(dá)CD34、CD45（圖1）；提示成功獲取并培養(yǎng)mADSC。

1.2.2 mADSC來(lái)源外泌體的提取與鑒定 取3～4代mADSC，待其生長(zhǎng)融合度達(dá)80%后，將完全培養(yǎng)基更換為無(wú)血清α-MEM 培養(yǎng)基，48 h 后收集細(xì)胞上清。按說(shuō)明書(shū)加入適當(dāng)體積的ExoQuick-TC 外泌體提取試劑，4 ℃條件下孵育過(guò)夜，1 500 g 離心30 min、離心半徑15 cm，分離外泌體。磷鎢酸染色后透射電鏡下顯示其為圓形或橢圓形，包膜完整（圖2）；粒徑分析技術(shù)檢測(cè)其直徑為30～220 nm（圖3），與 HESSVIK 等［6］檢測(cè)結(jié)果一致；Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示其表達(dá)TSG101、CD81、GAPDH 蛋白，不表達(dá)高爾基體相關(guān)蛋白GM130（圖4）；提示成功提取mADSC 來(lái)源外泌體。將分離后的外泌體后用1 mL無(wú)菌PBS溶解，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 提取細(xì)胞的表面標(biāo)志物表達(dá)情況（流式細(xì)胞術(shù)）

圖2 mADSC來(lái)源外泌體形態(tài)鑒定結(jié)果（透射電鏡）

圖3 mADSC來(lái)源外泌體粒徑分析鑒定結(jié)果

圖4 mADSC來(lái)源外泌體表面標(biāo)志物鑒定結(jié)果

1.2.3 血漿外泌體的提取與鑒定 取雄性C57 小鼠血漿1 mL，根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入適當(dāng)體積ExoQuick-TC外泌體提取試劑，4 ℃條件孵育過(guò)夜，1 500 g離心30 min、離心半徑13.5 cm，參照1.2.2 的方法進(jìn)行鑒定，證實(shí)為外泌體。

1.3 心肌細(xì)胞、心臟組織對(duì)mADSC 來(lái)源外泌體的攝取情況觀察 將mADSC 來(lái)源外泌體重懸于無(wú)菌PBS 中，加入 5 μmol/L DiI 孵育 10 min。洗滌 DiI 標(biāo)記的外泌體，重懸于無(wú)菌PBS 中漂洗3 次，去除游離的DiI 和其他雜質(zhì)。①心肌細(xì)胞攝取情況觀察：將H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中，使用DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗進(jìn)行培養(yǎng)。待生長(zhǎng)融合度達(dá)80%后，按照1∶2比例傳代。將DiI標(biāo)記的外泌體加入正常傳代培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞，并在無(wú)血清條件下以2μg/mL 工作濃度孵育3 h，倒置顯微鏡觀察顯示H9C2 細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光。②心臟組織攝取情況觀察：取C57 小鼠2 只，尾靜脈注射DiI標(biāo)記的外泌體（1 μg/μL）20 μL，12 h 后取小鼠心臟進(jìn)行冰凍切片，共聚焦顯微鏡觀察顯示小鼠心臟組織出現(xiàn)紅色熒光。以上結(jié)果提示，mADSC 來(lái)源外泌體可被H9C2細(xì)胞及小鼠心臟組織攝取。

1.4 mADSC 來(lái)源外泌體對(duì)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷影響的觀察

1.4.1 細(xì)胞分組處理 將H9C2細(xì)胞按1.3的方法培養(yǎng)于10 cm2培養(yǎng)皿中，待生長(zhǎng)融合度達(dá)80%后，分為損傷1組、處理1組和對(duì)照1組。損傷1組、處理1組均加入無(wú)菌PBS稀釋的阿霉素（終濃度為1μmol/L），處理1組同時(shí)加入終濃度為2μg/mL的mADSC來(lái)源外泌體，對(duì)照1組加入等體積的PBS，作用24 h后收集細(xì)胞。

1.4.2 細(xì)胞凋亡能力觀察 ①TUNEL 染色法：取各組細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定10 min 后，PBS 漂洗3 次。配置0.5% Triton 溶液，在細(xì)胞爬片中滴入適量體積 Triton 溶液，10 min 后用 PBS 漂洗 3 次。按說(shuō)明書(shū)將TUNEL 染色試劑盒中的A、B 液進(jìn)行混合，避光條件下將混合液滴加到細(xì)胞爬片上，37 ℃條件下孵育60 min。將細(xì)胞爬片用PBS 漂洗后，使用共聚焦顯微鏡觀察并對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。②流式細(xì)胞術(shù)：取各組細(xì)胞，消化后收集細(xì)胞，將1×105個(gè)細(xì)胞重懸于200μL Binding Buffer中。加入0.5 mg/mL PI溶 液 4 μL 和 Annexin V-FITC 溶 液 2 μL（Annexin V-FITC 最大激發(fā)光為488 nm、發(fā)射光為520 nm，PI最大激發(fā)光為535 nm、發(fā)射光為617 nm），室溫避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 mADSC 來(lái)源外泌體對(duì)阿霉素所致小鼠心肌損傷影響的觀察

1.5.1 阿霉素心肌損傷動(dòng)物模型建立及分組處理 取雄性C57小鼠18只，隨機(jī)分為損傷2組、處理2 組和對(duì)照 2 組，每組 6 只。損傷 2 組與處理 2 組尾靜脈注射阿霉素10 mg/kg，處理2組同時(shí)尾靜脈注射mADSC來(lái)源外泌體20μL（濃度為1μg/μL），對(duì)照組尾靜脈注射等體積生理鹽水；1次/周，連續(xù)4周。

1.5.2 心肌組織細(xì)胞凋亡情況觀察 采用TUNEL染色法。各組處理4周后分別取3只小鼠，處死后取出心臟，用刀片單向切割成3～4 mm2大小的組織塊，進(jìn)行常規(guī)固定、脫水透明、浸蠟、包埋，4～6 μm厚度切片。4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次。參照1.4.2 采用TUNEL 染色對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5.3 心臟纖維化情況觀察 采用Masson 染色。將1.5.2 獲取的心臟切片脫蠟至水，Weiger 鐵蘇木素染5～10 min，PBS 漂洗后5.1%鹽酸乙醇分化；流水沖洗后麗春紅酸性品紅液染5～10 min，蒸餾水稍沖洗，1%磷鉬酸水溶液處理約5 min；苯胺藍(lán)液或綠液復(fù)染5 min，11.1%醋酸處理1 min，95%乙醇脫水多次；無(wú)水乙醇脫水，Xylenes 透明，中性樹(shù)膠封片。判讀結(jié)果，膠原纖維、黏液、軟骨染色呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、肌肉、纖維素、紅細(xì)胞染色呈紅色，細(xì)胞核染色呈藍(lán)黑色，記錄三組染色情況并計(jì)算膠原纖維占心臟面積的百分比，簡(jiǎn)稱(chēng)纖維化比例。

1.5.4 左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）測(cè)量 各組處理4周后分別取3 只小鼠，2.5%～3.0%異氟烷麻醉，使用配備有13～24 MHz傳感器的Vevo 2100超聲成像儀進(jìn)行檢測(cè)，在乳頭肌中段水平進(jìn)行二維短軸M 型超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)量LVEF。

1.6 小鼠血漿外泌體與mADSC 來(lái)源外泌體中miR-21a-5p 表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。將血漿外泌體與mADSC 來(lái)源外泌體重懸于250μL PBS 中，并溶解于 750 μL TRIzol 試劑中，提取總RNA。在 RNA 沉淀過(guò)程中添加 GlycoBlue 5 μL，通過(guò)Agilent 2100 生物分析儀測(cè)量總RNA。使用QIA?Quick PCR 純化試劑盒（Qiagen）進(jìn)行純化，miRNA qRT-PCR試劑盒檢測(cè)miR-21a-5p表達(dá)。

1.7 miR-21a-5p 作用靶點(diǎn)的 GO 功能、KEGG 通路富 集 分 析 利 用“clusterProfiler”“enrichplot”“gg?plot2”軟件包進(jìn)行基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析。GO 功能富集分析主要包括生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF），基于GO 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行顯著性分析。KEGG 通路富集分析是依據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異的基因進(jìn)行通路顯著性分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0、R3.63 軟件和GraphPad Prism7 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較和組內(nèi)比較分別采用成組t檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 損傷1組、處理1組和對(duì)照1組細(xì)胞凋亡情況比較 損傷1組、處理1組和對(duì)照1組細(xì)胞凋亡數(shù)和細(xì)胞凋亡率均逐漸降低，組間兩兩比較P均＜0.05。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡數(shù)及凋亡率比較（±s）

表1 各組細(xì)胞凋亡數(shù)及凋亡率比較（±s）

注：與對(duì)照1組比較，*P＜0.05；與處理1組比較，#P＜0.05。

組別損傷1組處理1組對(duì)照1組細(xì)胞凋亡數(shù)（個(gè)）103±5*#44±4*13±3細(xì)胞凋亡率（%）23.2±0.1*#8.6±0.3*2.2±0.2

2.2 損傷2 組、處理2 組和對(duì)照2 組小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況比較 損傷2 組、處理2 組和對(duì)照2組小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡數(shù)和細(xì)胞凋亡率均依次降低，組間兩兩比較P均＜0.05。見(jiàn)表2。

表2 損傷2組、處理2組和對(duì)照2組小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡數(shù)及凋亡率比較（-x± s）

2.3 損傷2 組、處理2 組和對(duì)照2 組小鼠心臟纖維化情況、LVEF 比較 損傷2 組、處理2 組和對(duì)照2組小鼠心肌組織纖維化比例依次降低、LVEF 依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見(jiàn)表3。

表3 損傷2組、處理2組和對(duì)照2組小鼠心肌組織纖維化比例及LVEF比較（%，±s）

表3 損傷2組、處理2組和對(duì)照2組小鼠心肌組織纖維化比例及LVEF比較（%，±s）

注：與對(duì)照2組比較，*P＜0.05；與處理2組比較，#P＜0.05。

組別損傷2組處理2組對(duì)照2組n 6 6 6纖維化比例11.5±3.2*#5.1±0.3*2.3±0.1 LVEF 0.39±0.04*#0.60±0.03*0.79±0.03

2.4 小鼠血漿外泌體與mADSC來(lái)源外泌體中miR-21a-5p表達(dá)比較 小鼠血漿外泌體與mADSC來(lái)源外泌體中miR-21a-5p 相對(duì)表達(dá)量分別為1.05±0.01、5.41± 0.05，二者比較P＜0.05。

2.5 miR-21a-5p 的 GO 功能、KEGG 通路富集分析結(jié)果 GO 功能分析結(jié)果顯示，miR-21a-5p主要富集在輸尿管芽形成、泛素結(jié)合酶復(fù)合物、突觸囊泡聚集、竇房結(jié)細(xì)胞與心房肌細(xì)胞的通訊、回旋處連接、核糖體拆卸、回旋處大亞基結(jié)合、肺形態(tài)發(fā)生因子參與的上皮細(xì)胞增殖調(diào)控、rDNA 連接、K6 相關(guān)蛋白泛素化等通路。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，miR-21a-5p 可調(diào)控多種信號(hào)通路，如DNA 損傷修復(fù)、mTOR 信號(hào)通路、血管平滑肌舒張相關(guān)信號(hào)通路、脂肪酸代謝相關(guān)通路等。

3 討論

阿霉素是蒽環(huán)類(lèi)藥物的代表性藥物，也是治療多種癌癥的首選藥物之一，但其臨床應(yīng)用受到劑量依賴(lài)性以及延遲性心臟毒性的限制。阿霉素導(dǎo)致的心臟損傷往往為不可逆性心肌損傷，主要表現(xiàn)為惡性心律失常、擴(kuò)張性心肌病、心功能不全以及心力衰竭等［1-2］。阿霉素引起心肌損傷機(jī)制極為復(fù)雜，其主要機(jī)制包括：①阿霉素與NADH 脫氫酶和細(xì)胞色素P-450 還原酶發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生大量活性氧（ROS），ROS 蓄積導(dǎo)致心肌損傷［7-8］；②阿霉素與DNA 相互作用，并抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ（Top2β）生成，從而抑制DNA 解旋，并最終阻止蛋白質(zhì)合成，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［9］；③阿霉素可引起心肌細(xì)胞中鐵代謝異常，導(dǎo)致心肌細(xì)胞中線(xiàn)粒體DNA 損傷，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［10］。盡管關(guān)于阿霉素導(dǎo)致心肌損傷的分子機(jī)制研究較多，但相關(guān)靶點(diǎn)藥物及治療策略仍未在臨床上進(jìn)行推廣使用。因此，探究一種新型心肌保護(hù)策略對(duì)于減輕阿霉素所致心肌損傷至關(guān)重要。

既往研究表明，MSCs 是一種多能祖細(xì)胞，可以通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分化、組織修復(fù)、抗炎和免疫抑制等多種機(jī)制來(lái)減輕動(dòng)物心肌損傷和改善患者心臟功能［11-12］。但是，宿主移植的MSC 生存率低，只有一小部分移植MSC 在其可能的靶組織中存活，這極大地限制了MSC的臨床應(yīng)用。盡管存在這些限制，但細(xì)胞具有旁分泌作用，移植后存活的MSC在某些情況下仍能正常工作。MSC可以分泌大量生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子，這些因子可以促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞凋亡、改善缺血性微環(huán)境并動(dòng)員內(nèi)源性心臟干細(xì)胞［13］。同樣，MSC可以通過(guò)分泌外泌體來(lái)調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的生物學(xué)功能。既往研究表明，BMSCs來(lái)源外泌體可促進(jìn)心肌缺血模型中的心肌細(xì)胞存活并延緩心肌結(jié)構(gòu)重塑［13］。但 BMSCs 獲取困難，增殖能力較弱，而mADSC則容易獲取且其增殖能力強(qiáng)于BMSCs。

外泌體功能的發(fā)揮需要細(xì)胞和組織的攝取，從而釋放活性物質(zhì)，對(duì)相應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)。為使得外泌體的攝取功能可視化，首先需要對(duì)外泌體進(jìn)行標(biāo)記。DiI是一種親脂性的熒光染料，可以用來(lái)對(duì)細(xì)胞膜和其他脂溶性生物結(jié)構(gòu)染色，常用于外泌體標(biāo)記。當(dāng)被綠光激發(fā)并結(jié)合到細(xì)胞膜中時(shí)，DiI會(huì)發(fā)出強(qiáng)紅色熒光，并且不會(huì)破壞膜的特性。本研究結(jié)果顯示，小鼠mADSC來(lái)源外泌體可以減輕阿霉素所致H9C2細(xì)胞和小鼠心肌細(xì)胞凋亡，減輕阿霉素所致小鼠的心肌纖維化及心功能下降。

miR-21a-5p 是一種心臟保護(hù)性miRNA，而外泌體中富含miRNA，因此本研究檢測(cè)了小鼠血漿外泌體與干細(xì)胞外泌體中miR-21a-5p 表達(dá)情況，驗(yàn)證干細(xì)胞外泌體是否通過(guò)增加miR-21a-5p 表達(dá)來(lái)保護(hù)心臟。本研究結(jié)果顯示，mADSC 來(lái)源外泌體miR-21a-5p 表達(dá)顯著高于血漿外泌體，推測(cè)mADSC 來(lái)源外泌體通過(guò)升高miR-21a-5p 表達(dá)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。利用GO 數(shù)據(jù)庫(kù)可以得到目標(biāo)基因在CC、MF 和BP 三個(gè)層面上主要和哪些分子功能和生物過(guò)程有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，miR-21a-5p 可調(diào)控多種信號(hào)通路，如DNA 損傷修復(fù)、mTOR 信號(hào)通路、血管平滑肌舒張相關(guān)信號(hào)通路、脂肪酸代謝相關(guān)通路等，這提示mADSC 來(lái)源外泌體可升高miR-21a-5p表達(dá)并通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)保護(hù)心肌。此外，mADSC 來(lái)源外泌體中核酸及蛋白含量豐富，其他蛋白、miRNA 及IncRNA 是否在阿霉素所致的心臟損傷中發(fā)揮保護(hù)作用尚未可知。因此，mAD?SC 來(lái)源外泌體中的其他成分還有待進(jìn)一步檢測(cè)及研究。

綜上所述，mADSC 來(lái)源外泌體可減少阿霉素所致心肌細(xì)胞凋亡，減輕阿霉素所致小鼠心肌纖維化并提高其心功能，其機(jī)制可能與升高miR-21a-5p 表達(dá)進(jìn)而調(diào)控多種信號(hào)通路有關(guān)。盡管mADSC來(lái)源外泌體能夠發(fā)揮心肌保護(hù)作用，但其在臨床上的應(yīng)用還面臨重大挑戰(zhàn)。外泌體通過(guò)不同注射途徑注射進(jìn)入小鼠后的主要富集器官各不相同，靜脈注射外泌體主要富集于肝臟、脾臟以及肺臟，而腹腔注射外泌體主要富集于腹腔臟器［14］。由于心臟內(nèi)血流速度快且單核吞噬細(xì)胞含量較低，故外泌體在心臟內(nèi)的濃度較低，低劑量外泌體無(wú)法起到應(yīng)有的保護(hù)作用，而增加外泌體濃度則無(wú)法排除其對(duì)肝臟、脾臟等其他器官的影響［15］。因此，如何提高外泌體在心臟內(nèi)的富集濃度是解決外泌體治療心臟疾病的關(guān)鍵問(wèn)題。