農(nóng)志歡，何飛 ，蘇華，董曉倩

1 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧530021；2 廣西中醫(yī)藥研究院；3 廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

腹瀉對(duì)兒童健康危害極大，是造成小兒營(yíng)養(yǎng)不良、生長(zhǎng)發(fā)育障礙及死亡的重要原因之一，也是引起兒童患病和死亡的第二大病因，在許多發(fā)展中國(guó)家甚至是造成兒童死亡的第一原因［1-3］。滇白珠是杜鵑花科白珠樹(shù)屬植物全株［4］，是一種經(jīng)典的瑤藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，滇白珠具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗氧化等藥理作用［5-6］。前期研究發(fā)現(xiàn)，滇白珠提取物能顯著減少蓖麻油所致腹瀉小鼠的腹瀉次數(shù)，減輕新斯的明導(dǎo)致的胃排空和小腸推進(jìn)功能亢進(jìn)，抑制大鼠離體回腸痙攣性收縮［7］。本課題組前期進(jìn)一步分離滇白珠提取物，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，并對(duì)各個(gè)部位進(jìn)行了藥效初步篩選，發(fā)現(xiàn)滇白珠的乙酸乙酯部位活性最強(qiáng)。2018 年 12 月—2019 年 4 月，本研究制備了滇白珠的乙酸乙酯提取物，并觀察其對(duì)腹瀉小鼠的止瀉作用及胃腸功能調(diào)節(jié)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級(jí)SD 大鼠8 只，體質(zhì)量200～220 g；昆明小鼠200 只，體質(zhì)量18～22 g；雌雄參半，均購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002；動(dòng)物觀察室設(shè)置溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，雌雄分飼，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。藥物與試劑：滇白珠購(gòu)自廣西金秀瑤族自治縣，由廣西中醫(yī)藥研究院何開(kāi)家主任（中藥師）鑒定為杜鵑花科植物滇白珠的全株。易蒙停（生產(chǎn)批號(hào)：180511650）購(gòu)自西安楊森制藥有限公司，甲硫酸新斯的明（生產(chǎn)批號(hào)：1208171）購(gòu)自河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司，硫酸阿托品（生產(chǎn)批號(hào)：93120220）購(gòu)自成都制藥一廠，氯化乙酰膽堿（生產(chǎn)批號(hào)：112120103）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，蓖麻油（生產(chǎn)批號(hào)：20120813）購(gòu)自廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，番瀉葉（生產(chǎn)批號(hào)：18101702）購(gòu)自國(guó)藥仁樂(lè)堂河北藥業(yè)有限公司。

1.2 藥物制備

1.2.1 滇白珠乙酸乙酯提取物（簡(jiǎn)稱滇白珠提取物）制備 取滇白珠藥材1 kg，水煮3 次，每次加10倍量水。第 1 次煮 2 h，第 2、3 次各煮1 h，濃縮水液至密度約為1.10。加95%乙醇至溶液的乙醇含量達(dá)70%，靜置沉淀，收集上清液。沉淀物用70%乙醇洗滌3次，合并乙醇液，回收溶劑，得到乙醇浸膏。加水溶解，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，回收溶劑，得到滇白珠提取物，得率約為0.8%。

1.2.2 番瀉葉提取物制備 稱取300 g 番瀉葉藥材，加入100 ℃純凈水1.5 L，水浴保溫且不斷攪拌30 min，雙層濾布?jí)赫ミ^(guò)濾，獲得濃度為20%的番瀉葉藥汁900 mL，4 ℃冰箱保存。

1.3 滇白珠提取物對(duì)腹瀉小鼠止瀉作用的觀察

1.3.1 滇白珠提取物對(duì)小腸性腹瀉小鼠止瀉作用的觀察 取昆明小鼠50只，隨機(jī)分成5部分，每部分10只，分別按照體質(zhì)量灌胃給予20、10、5 g/kg（按生藥計(jì)算）的滇白珠提取物及6 mg/kg 易蒙停、等體積溶媒（3.2%吐溫-80溶液），1次/d，持續(xù)7 d。末次給藥1 h 后，所有小鼠灌胃給予蓖麻油10 mL/kg，立即將小鼠單只置于鼠籠中，觀察并記錄5 h內(nèi)每間隔1 h小鼠的正常便數(shù)、稀便數(shù)、稀便級(jí)，根據(jù)稀便率、稀便級(jí)計(jì)算腹瀉指數(shù)（腹瀉指數(shù)=稀便率×稀便級(jí)）。

1.3.2 滇白珠提取物對(duì)大腸性腹瀉小鼠止瀉作用的觀察 取昆明小鼠50只，隨機(jī)分成5部分，每部分10 只。參照 1.3.1 的方法進(jìn)行分組處理，1 次/d，持續(xù)7 d。末次給藥1 h 后，所有小鼠灌胃給予番瀉葉提取物2.5 g/kg，后續(xù)操作及觀察指標(biāo)同1.3.1。

1.4 滇白珠提取物對(duì)小鼠胃腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)影響的觀察

1.4.1 滇白珠提取物對(duì)正常小鼠胃腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)影響的觀察 采用炭末推進(jìn)試驗(yàn)。取昆明小鼠50只，隨機(jī)分成5 部分，每部分10 只。參照1.3.1 的方法進(jìn)行分組處理，1 次/d，持續(xù)5 d。第4 天給藥后小鼠禁食（不禁水）24 h，第5 天末次給藥1 h 后，每間隔2 min 對(duì)不同組號(hào)順序的小鼠灌胃給予黑色炭末糊0.8 g。20 min 后脫頸處死小鼠，快速剖腹，結(jié)扎小鼠胃賁門和幽門，取出胃組織。先稱量胃全重，將胃內(nèi)殘留物清理干凈，再稱量胃凈重。計(jì)算小鼠胃內(nèi)殘留物的重量（胃內(nèi)殘留物重量=胃全重-胃凈重）及胃內(nèi)殘留率［胃內(nèi)殘留率（%）=胃內(nèi)殘留物重量/炭末糊重量×100%］。同時(shí)取出小腸，自然平鋪在尺子上，測(cè)量小腸總長(zhǎng)度（胃幽門至回盲部的長(zhǎng)度）及炭末糊推進(jìn)長(zhǎng)度（胃幽門至炭末糊推進(jìn)前沿的長(zhǎng)度），計(jì)算小腸推進(jìn)率［小腸推進(jìn)率（%）=炭末糊推進(jìn)前沿的長(zhǎng)度/小腸總長(zhǎng)×100%］。

1.4.2 滇白珠提取物對(duì)胃腸功能亢進(jìn)小鼠胃腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)影響的觀察 采用炭末推進(jìn)試驗(yàn)。取昆明小鼠50只，隨機(jī)分成5部分，每部分10只。參照1.3.1的方法進(jìn)行分組處理，1 次/d，持續(xù)5 d。第4 天給藥后小鼠禁食（不禁水）24 h，第5天末次給藥1 h后，每間隔2 min 對(duì)不同組號(hào)順序的小鼠皮下注射甲硫酸新斯的明0.15 mg/kg，20 min后每間隔2 min對(duì)不同組號(hào)順序的小鼠灌胃給予黑色炭末糊0.8 g，后續(xù)操作及觀察指標(biāo)同1.4.1。

1.5 滇白珠提取物對(duì)大鼠離體小腸張力影響的觀察

1.5.1 離體腸段制備 取SPF 級(jí)SD 大鼠8 只，禁食不禁水24 h。脫頸處死，快速剖腹，取一段小腸，置于4 ℃臺(tái)氏液中，剪成若干約1 cm的腸段備用。

1.5.2 滇白珠提取物對(duì)大鼠離體正常小腸張力影響的觀察 預(yù)先開(kāi)啟ZH-Z離體器官檢測(cè)系統(tǒng)，使水浴溫度保持在37 ℃左右，通入空氣，調(diào)節(jié)好空氣流量。取1.5.1制備的1條小腸段，兩端對(duì)角穿線將其放在盛有20 mL 臺(tái)氏液的恒溫浴管中。連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)離體小腸段基礎(chǔ)張力為0.5 g 左右。待其運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定后，往浴槽中分別加入9、4.5、2.25 g/mL 的滇白珠提取物100 μL（終濃度分別為44.78、22.39、11.19 μg/mL）及0.02 mg/mL 硫酸阿托品（終濃度為0.1μg/mL）、溶媒各100μL，分別記錄小腸藥物作用前的基礎(chǔ)張力以及作用2.5、5.0 min的張力。計(jì)算作用2.5、5.0 min 的張力抑制率。張力抑制率（%）=（基礎(chǔ)張力-作用后張力）/基礎(chǔ)張力×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次，取平均值。

1.5.3 滇白珠提取物對(duì)大鼠離體張力亢進(jìn)小腸張力影響的觀察 取1.5.1 制備的1 條小腸段置于浴槽中，待腸段收縮穩(wěn)定后，加入氯化乙酰膽堿（終濃度15 mg/L），使小腸張力亢進(jìn)。待小腸運(yùn)動(dòng)3.0 min后，往浴槽中分別加入9、4.5、2.25 g/mL 的滇白珠提取 物 200 μL（終 濃 度分 別為 89.11、44.56、22.28 μg/mL）及0.02 mg/mL 硫酸阿托品（終濃度為0.2 μg/mL）、溶媒各200 μL，分別記錄小腸藥物作用前的基礎(chǔ)張力及加入乙酰膽堿平臺(tái)期、藥物作用2.5 min、藥物作用5.0 min 的張力。計(jì)算給藥后2.5、5.0 min 的張力抑制率。張力抑制率（%）=（加入乙酰膽堿平臺(tái)期張力-作用后張力）/（加入乙酰膽堿平臺(tái)期張力-基礎(chǔ)張力）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以-x±s 表示，方差齊時(shí)多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用Dunnett′sT3檢驗(yàn)，兩組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物作用后小腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級(jí)及腹瀉指數(shù)比較 與溶媒作用后比較，20、10 g/kg滇白珠提取物及易蒙停作用后小腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級(jí)及腹瀉指數(shù)均降低，5 g/kg滇白珠提取物作用后小腸性腹瀉小鼠稀便率、腹瀉指數(shù)均降低（P均＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 不同藥物作用后小腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級(jí)及腹瀉指數(shù)比較（±s）

表1 不同藥物作用后小腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級(jí)及腹瀉指數(shù)比較（±s）

注：與溶媒作用后比較，*P＜0.01；與易蒙停作用后比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

藥物20 g/kg滇白珠提取物10 g/kg滇白珠提取物5 g/kg滇白珠提取物易蒙停溶媒n 10 10 10 10 10稀便率（%）0.53±0.13*0.62±0.11*0.64±0.07*#0.54±0.13*0.80±0.08稀便級(jí)1.00±0.00*1.03±0.11*1.09±0.20 1.04±0.09*1.21±0.10腹瀉指數(shù)0.53±0.13*0.63±0.09*0.69±0.09*##0.55±0.12*0.96±0.13

2.2 不同藥物作用后大腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級(jí)及腹瀉指數(shù)比較 與溶媒作用后比較，20、10 g/kg滇白珠提取物及易蒙停作用后大腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級(jí)及腹瀉指數(shù)均降低，5 g/kg滇白珠提取物作用后大腸性腹瀉小鼠稀便級(jí)、腹瀉指數(shù)均降低 （P均＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 不同藥物作用后大腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級(jí)及腹瀉指數(shù)比較（±s）

表2 不同藥物作用后大腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級(jí)及腹瀉指數(shù)比較（±s）

注：與溶媒作用后比較，*P＜0.01；與易蒙停作用后比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

藥物n 稀便率（%） 稀便級(jí) 腹瀉指數(shù)20 g/kg滇白珠提取物10 g/kg滇白珠提取物5 g/kg滇白珠提取物易蒙停溶媒10 10 10 10 10 0.34±0.06*0.44±0.07*#0.53±0.06##0.33±0.13*0.58±0.08 1.03±0.06*1.08±0.08*1.06±0.07*1.06±0.16*1.30±0.12 0.35±0.06*0.48±0.08*#0.57±0.06*##0.34±0.12*0.76±0.11

2.3 不同藥物作用后正常小鼠胃內(nèi)殘留率、小腸推進(jìn)率比較 見(jiàn)表3。

表3 不同藥物作用后正常小鼠胃內(nèi)殘留率、小腸推進(jìn)率比較（%，±s）

表3 不同藥物作用后正常小鼠胃內(nèi)殘留率、小腸推進(jìn)率比較（%，±s）

注：與溶媒作用后比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與易蒙停作用后比較，#P＜0.05。

藥物20 g/kg滇白珠提取物10 g/kg滇白珠提取物5 g/kg滇白珠提取物易蒙停溶媒n 10 10 10 10 10胃內(nèi)殘留率53.33±12.71 52.27±15.43 51.16±18.03 54.72±14.36 44.61±15.76小腸推進(jìn)率49.31± 5.94**53.14± 5.69*58.18± 9.54#47.74±11.71*58.68± 5.49

2.4 不同藥物作用后胃腸功能亢進(jìn)小鼠胃內(nèi)殘留率、小腸推進(jìn)率比較 見(jiàn)表4。

表4 不同藥物作用后胃腸功能亢進(jìn)小鼠胃內(nèi)殘留率、小腸推進(jìn)率比較（%，-x±s）

2.5 不同藥物作用前后大鼠離體正常小腸張力及 張力抑制率比較 見(jiàn)表5。

表5 不同藥物作用前后大鼠離體正常小腸張力及張力抑制率比較（±s）

表5 不同藥物作用前后大鼠離體正常小腸張力及張力抑制率比較（±s）

注：與溶媒作用后比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與硫酸阿托品作用后比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

藥物44.78μg/mL滇白珠提取物22.39μg/mL滇白珠提取物11.19μg/mL滇白珠提取物硫酸阿托品溶媒基礎(chǔ)張力（g）0.60±0.07 0.60±0.04 0.59±0.07 0.62±0.08 0.61±0.09作用2.5 min張力（g）0.31±0.06**##0.33±0.06**##0.39±0.12*0.43±0.06*0.55±0.12作用2.5 min張力抑制率（%）49.01± 9.29**##44.51±11.57**#34.55±11.11**30.06±11.18**9.83± 9.69作用5.0 min張力（g）0.25±0.06**##0.27±0.05**##0.37±0.14*0.39±0.07*0.52±0.14作用5.0 min張力抑制率（%）58.52± 8.70**##54.86± 8.63**##38.15±13.54**36.36±14.27**15.33±13.11

2.6 不同藥物作用前后大鼠離體張力亢進(jìn)小腸 張力及張力抑制率比較 見(jiàn)表6。

表6 不同藥物作用前后大鼠離體張力亢進(jìn)小腸張力及張力抑制率比較（±s）

表6 不同藥物作用前后大鼠離體張力亢進(jìn)小腸張力及張力抑制率比較（±s）

注：與溶媒作用后比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與硫酸阿托品作用后比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

藥物89.11μg/mL滇白珠提取物44.56μg/mL滇白珠提取物22.28μg/mL滇白珠提取物硫酸阿托品溶媒基礎(chǔ)張力（g）0.49±0.05 0.48±0.05 0.46±0.04 0.48±0.04 0.49±0.07加入乙酰膽堿平臺(tái)期張力（g）3.27±0.31 3.34±0.91 3.62±1.04 3.23±0.54 3.16±0.27作用2.5 min張力（g）1.41±0.20**##2.12±0.58*##2.84±0.72*##0.97±0.20**2.90±0.36作用2.5 min張力抑制率（%）67.25±4.49**##43.09±4.15**##24.07±6.74**##82.28±5.84**10.02±7.23作用5.0 min張力（g）1.13±0.21**#1.80±0.50*##2.41±0.61##0.87±0.20**2.52±0.47作用5.0 min張力抑制率（%）77.32± 6.83**#54.00± 5.26**##37.78± 8.31*##86.05± 6.45**24.51±11.76

3 討論

滇白珠具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗氧化等藥理作用［5-6］。前期研究采用不同極性的有機(jī)溶劑對(duì)滇白珠水提取物進(jìn)行萃取及活性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取物在抗腹瀉和胃腸功能調(diào)節(jié)方面均有較好的活性，可能是滇白珠抗腹瀉和胃腸功能調(diào)節(jié)的活性部位［7］。易蒙停通用名為鹽酸洛哌丁胺膠囊，用于各種原因引起的非感染性急、慢性腹瀉的對(duì)癥治療。此外，易蒙?？梢种颇c道平滑肌的收縮，減少腸蠕動(dòng)；還可減少腸壁神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，通過(guò)膽堿能和非膽堿能神經(jīng)元局部的相互作用，直接抑制蠕動(dòng)反射［8-9］。因此，本研究將易蒙停作為腹瀉和胃腸功能試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照藥。

番瀉葉作用于大腸，可促進(jìn)結(jié)腸的水和電解質(zhì)凈分泌，加速大腸內(nèi)容物輸送而致瀉。蓖麻油刺激小腸，能損害腸黏膜細(xì)胞，引起炎癥而致瀉［10-11］。本研究結(jié)果顯示，不同濃度滇白珠提取物對(duì)小腸性和大腸性腹瀉小鼠均具有顯著的止瀉作用，其中20 g/kg滇白珠提取物的作用效果與易蒙停相當(dāng)；這提示滇白珠提取物可應(yīng)用于各種原因引起的腹瀉治療，具有多靶點(diǎn)、多機(jī)制作用的特點(diǎn)。

腹瀉的發(fā)生與胃腸道功能息息相關(guān)。胃具有收納食物，對(duì)食物進(jìn)行酸化、研磨形成食糜，并節(jié)奏性地排送入腸的功能［12］。胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)涉及交感神經(jīng)系統(tǒng)、副交感神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)系統(tǒng)等多種神經(jīng)系統(tǒng)，其中胃腸道平滑肌細(xì)胞膜上M 膽堿能受體發(fā)揮著非常重要的作用。副交感神經(jīng)末梢釋放的乙酰膽堿可激活M 膽堿能受體，而膽堿酯酶抑制劑新斯的明能保護(hù)乙酰膽堿免于破壞，使胃腸道平滑肌的M膽堿能受體持續(xù)激活，造成胃腸運(yùn)動(dòng)機(jī)能亢進(jìn)。研究顯示，胃腸內(nèi)容物推進(jìn)速度減慢，可能由胃排空速度減慢或小腸推進(jìn)速度減慢兩方面因素促成的［13-14］。本研究采用新斯的明建立胃腸功能亢進(jìn)小鼠模型，以炭末推進(jìn)情況反映小鼠的胃腸推進(jìn)功能，結(jié)果顯示不同濃度的滇白珠提取物對(duì)正常小鼠和胃腸功能亢進(jìn)小鼠的小腸推進(jìn)率均有明顯的抑制作用，并可明顯增加胃腸功能亢進(jìn)小鼠的胃內(nèi)殘留率，但是對(duì)正常小鼠的胃內(nèi)殘留率影響不大，這提示滇白珠提取物可能通過(guò)對(duì)胃腸道M 膽堿能受體的抑制作用發(fā)揮胃腸功能調(diào)節(jié)作用。而滇白珠提取物對(duì)正常小鼠的胃內(nèi)殘留率影響不明顯，分析原因可能是其對(duì)胃腸亢進(jìn)狀態(tài)小鼠推進(jìn)功能的抑制作用大于正常小鼠，也可能與其對(duì)小腸運(yùn)動(dòng)的抑制作用大于對(duì)胃排空的抑制作用有關(guān)。為明確滇白珠提取物對(duì)M 膽堿能受體的作用特點(diǎn)，本研究采用離體小腸張力實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。乙酰膽堿可興奮小腸平滑肌運(yùn)動(dòng)，而阿托品為M 膽堿能受體拮抗劑，對(duì)胃腸痙攣有抑制作用［15］。本研究結(jié)果顯示，不同濃度滇白珠提取物與阿托品對(duì)大鼠離體小腸平滑肌的自發(fā)張力均有顯著抑制作用，同時(shí)對(duì)乙酰膽堿所造成的小腸平滑肌收縮也有明顯的抑制作用。因此，滇白珠提取物與阿托品一樣能競(jìng)爭(zhēng)性拮抗乙酰膽堿所造成的M膽堿能受體作用。

綜上所述，滇白珠提取物對(duì)大腸及小腸性腹瀉小鼠均具有明顯的止瀉作用，其機(jī)制可能與通過(guò)拮抗M 膽堿能受體而增加胃內(nèi)殘留率、降低小腸推進(jìn)速度、解除胃腸道平滑肌痙攣有關(guān)。